The authors thank Uwe Plessmann, Monika Raabe und Silvia M&#252;nch for technical support.

Toutes les expériences sur des échantillons de tissus ou de sang humain doivent être approuvés par un comité d&#39;éthique et menées selon des directives données dans le vote d&#39;éthique. 1. Enrichissement Cellulaire <ol><li> Tumeurs liquides / tri cellulaire activé par fluorescence. <ol><li> Isoler les cellules mononucléaires de la moelle osseuse ou de sang en effectuant la lyse des érythrocytes en utilisant du chlorure d&#39;ammonium ou par gradient de densité Ficoll centrifugation. <ol><li> Pour la lyse des érythrocytes, mélanger 1 ml d&#39;échantillon avec 4 ml de solution de chlorure d&#39;ammonium. Incuber la solution sur la glace pendant 5 à 10 min. Ajouter 40 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + 2% de sérum de veau foetal (FCS) et centrifuger pendant 5 min à 400 x g et 4 ° C. </li><li> Pour gradient de Ficoll centrifugation, la couche 10 ml d&#39;échantillon sur 15 ml de Ficoll-Hypaque pour former deux couches distinctes (attention à ne pas déranger les couches). Centrifuger à 400 g pendant 30 min à température ambiante (15-25 ° C) avec précaution et récolter le mononucléairecellules qui se accumulent à l&#39;interphase. </li><li> Isoler les cellules et de les prendre en PBS + 2% de FCS. Centrifuger à 400 g pendant 5 min et prélever dans 1 ml de PBS + 2% FCS. Prendre une aliquote comme contrôle négatif et une aliquote pour chaque colorant fluorescent utilisé dans la tache finale. </li></ol></li><li> Incuber avec des anticorps utiles pour isoler la population de cellules leucémiques dans la dilution selon les instructions du fabricant sur de la glace pendant 30 min marquées par fluorescence. Tacher également les aliquotes utilisées pour la compensation avec chaque anticorps individuellement. Laver deux fois avec du PBS + 2% de FCS. REMARQUE: Les anticorps utilisés étaient de souris anti-humain contre CD117-PE (Clone 95C3), CD34-FITC (Clone 8G12) et CD33-PE (Clone P67.6). </li><li> cellules de filtre à travers 35 um tamis cellulaire, en utilisant idéalement tubes avec tamis cellulaire intégrés dans le bouchon. </li><li> Ajouter la viabilité cellulaire tache (par exemple, 7-AAD). Trier les cellules en utilisant un trieur de cellules approprié 11 (Figure 2). Recueillir cellules Isc<html> Moyen (l&#39;IMDM) de modification de Dulbecco ove contenant 10% de FCS. </li></ol></li><li> Les tumeurs solides / Laser-microdissection. <ol><li> Pour les expériences décrites, les échantillons FFPE échantillon de cancer du poumon ont été utilisés. Pour ce but tissu de cancer du poumon a été immédiatement fixée dans du formol tamponné à 4% après résection chirurgicale et des morceaux de 3 x 2 cm x 1 où incorporé dans de la paraffine pour une analyse ultérieure. </li><li> Couper des sections de 5 à 10 um d&#39;épaisseur de la paraffine (FFPE) échantillon fixé au formol avec un microtome. Sections de montage sur des lames de membrane film couverte et sèche à 37 ° C pendant 1 heure. Déparaffiner et réhydrater les sections montées par incubation successive dans le xylène, l&#39;éthanol absolu, 70% et de l&#39;eau, chacun pendant 1 min. </li><li> Colorer les sections avec hématoxyline pendant 20 secondes, puis rincer à l&#39;eau du robinet. Recueillir la population de cellules d&#39;intérêt en utilisant un système de microdissection laser capture (voir aussi 12). </li></ol></li></ol>titre &quot;Extraction des protéines&gt; 2. <ol><li> Tumeurs liquides. <ol><li> Centrifuger la suspension cellulaire de l&#39;étape 1.1.5 à 400 xg, 4 ° C pendant 4 minutes et éliminer le surnageant. Laver deux fois avec 500 ul de PBS froid et centrifugation pendant 5 min à 400 x g et 4 ° C </li><li> Ajouter 40 ul de tampon de lyse par 10 6 cellules et incuber pendant 15 min sur de la glace (10 5 cellules (env. 10 ug de protéine totale) doit être le nombre minimum de cellules). Centrifuger le lysat à 14 000 xg, 4 ° C pendant 10 min et transférer le surnageant (lysat cellulaire de effacée) dans un nouveau tube de réaction. Jeter le culot. </li></ol></li><li> Les tumeurs solides. <ol><li> Ajouter 60 ul de tampon de lyse de tissu au tissu microdissection et incuber pendant 15 min sur de la glace, de recueillir le fluide par centrifugation courte et transférer la suspension dans un nouveau tube de réaction. Soniquer le lysat sur la glace pendant 3 min. </li><li> Ajouter 15 ul de 20% de dodécylsulfate de sodium (SDS) à une co atteindre une finale de SDSncentration de 4%. Incuber le tissu microdissection à 99 ° C dans un bloc chauffant pendant 1 heure et agité à 600 tours par minute. Centrifuger le lysat à 16 000 x g, 18 ° C pendant 10 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube. </li></ol></li></ol> 3. Création d&#39;un SILAC Spike-Quantification en standard (Super-SILAC standard) NOTE: La norme de quantification se compose d&#39;un mélange de protéines SILAC marqué dérivé 4-6 lignées cellulaires qui correspondent au type d&#39;intérêt de la tumeur. Pour réaliser le chevauchement maximal entre le protéome de référence SILAC marqué et le protéome dérivée d&#39;une tumeur, une analyse en composantes principales doit être effectuée avant que les lignées cellulaires sont sélectionnés pour la norme de 14 quantification. <ol><li> Analyse en composantes principales (ACP). <ol><li> Afin de déterminer les profils d&#39;expression des protéines de lignées cellulaires, de cultiver une dizaine de différentes lignées cellulaires dans un milieu de culture cellulaire approprié. Lyse des cellules telles que décritesà l&#39;étape 2.1. Préparer lysats cellulaires pour la spectrométrie de masse comme décrit dans l&#39;étape 6.1. </li><li> Analyser le profil d&#39;expression protéique de chaque lignée cellulaire sur une haute résolution, chromatographie en phase liquide couplée à un spectromètre de masse (nanoLC-MS / MS). </li><li> Analyser les données brutes résultant en utilisant un logiciel libre et MaxQuant effectuer une analyse en composantes principales en utilisant le logiciel associé, comme Persée 16,17. </li><li> Sélectionnez 4-6 lignées cellulaires qui montrent la plus grande diversité entre leurs profils protéines expression et les utilisent pour générer la norme de pic-à Super-SILAC. </li></ol></li><li> SILAC-étiquetage et le contrôle de l&#39;étiquette. <ol><li> Cultiver les lignées cellulaires sélectionnées pendant au moins cinq cycles cellulaires dans un milieu de culture de cellules approprié SILAC, dans laquelle l&#39;arginine et la lysine sont marqués avec des isotopes stables du carbone et de l&#39;azote (milieu SILAC) 4. </li><li> Lyse des cellules comme décrit dans l&#39;étape 3.1 et préparer lysats cellulaires pour la spectrométrie de masse comme décrit dans l&#39;étape 6.1.Mesurer l&#39;efficacité d&#39;incorporation de l&#39;étiquetage SILAC par nanoLC-MS / MS. Analyser les données brutes de SM résultant avec MaxQuant et de déterminer l&#39;efficacité de SILAC-étiquetage. Ce résultat est obtenu en comptant le nombre de peptides identifiés dans leur marqué (lourde) et leurs formes endogènes (lumière), et le calcul du ratio (lourd) / (+ la lumière lourde). l&#39;efficacité de l&#39;étiquetage devrait dépasser 98%. </li></ol></li><li> Combinaison de protéomes de SILAC et validation. <ol><li> Cultiver et développer des lignées cellulaires sélectionnées selon les instructions du fabricant dans un milieu de SILAC appropriée. Lyse des cellules, comme décrit à l&#39;étape 2.1 pour les tumeurs liquides ou comme décrit dans l&#39;étape 3.2 de tumeurs solides et de déterminer la concentration en protéine de chaque lysat cellulaire. </li><li> Mélanger des quantités de protéines équimolaires de chaque lignée cellulaire et diviser le mélange dans aliquote. Snap-congeler les aliquotes et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à la mesure. Pour une expérience dont vous avez besoin de 20 à 50 ug de la norme Super-SILAC. Prenez soin de préparer le standard en excès que de changer le standard dans une série d&#39;expériences doit être évitée. </li></ol></li></ol> 4. Mesure de la concentration de protéines et Spike-in <ol><li> Tumeurs liquides. <ol><li> Utilisation essai de quantification de protéine déterminer les concentrations protéiques des lysats cellulaires les respectives et la norme Super-SILAC. </li><li> Mélanger des quantités égales de lysat cellulaire et le niveau autorisé, Super-SILAC et ensuite ajouter du dodécylsulfate de lithium (LDS) tampon (25% du volume de l&#39;échantillon) et l&#39;agent réducteur (10% du volume de l&#39;échantillon). </li><li> Chauffer la solution résultante dans un bloc chauffant à 72 ° C pendant 10 min. Eventuellement, stocker les protéines dénaturées résultant à -80 ° C. </li></ol></li><li> Les tumeurs solides. <ol><li> Pour la mesure de la concentration de protéine sur un lecteur de plaques, un mélange de sérum-albumine bovine standard (BSA) série de solution de dilution, et le lysat la norme Super-SILAC approprié avec une protéine disponible dans le commerce unéssayé dans une plaque de 96 puits et agiter pendant 1 min, incuber pendant le temps indiqué et mesurer l&#39;absorbance comme indiqué par le fabricant. REMARQUE: La forte concentration de SDS et de dithiothréitol (DTT) dans le lysat est un problème pour la plupart des dosages disponibles pour la détermination de la concentration en protéines. </li><li> Mélanger des quantités égales de lysat clarifié et la norme Super-SILAC avec 200 ul d&#39;urée dans l&#39;unité de filtration et centrifugation à 14 000 xg pendant 30 min à 20 ° C. Ne pas utiliser plus de 50 pi de lysat clarifié et la norme Super-SILAC. Eviter des températures inférieures à 15 ° C, de sorte que l&#39;urée ne cristallise pas. </li></ol></li></ol> 5. La séparation des échantillons et protéines Digest <ol><li> Tumeurs liquides. <ol><li> Séparée de 30 à 100 ug de protéine totale par voie sur une 4 - gradient gel SDS-PAGE à 12%. protéines de tache avec du bleu de Coomassie O / N. Retirer l&#39;excès de coloration Coomassie par deux lavages ultérieurs avec de l&#39;eau. </li><li> Couper chaque voie du gel et diviseren 23 tranches de taille égale, quel que soit le motif de coloration de gel. Traiter les tranches de gel séparément, chacun dans 0,6 ml dans un flacon de polypropylene. </li><li> Laver les tranches de gel avec de l&#39;eau et du méthanol / eau (50:50, v / v), de réduire de 10 mM de DTT par incubation pendant 30 min à 56 ° C. Alkyler les tranches de gel avec 55 mM d&#39;iodoacétamide (IAA) par incubation à 60 min à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Entre les étapes d&#39;échantillonnage-manipulation, se laver avec de l&#39;acétonitrile tranches pendant 15 min et sec dans un SpeedVac pour enlever l&#39;excès de solvant et d&#39;améliorer l&#39;absorption de la solution de réactif. </li><li> Effectuer une protease de clivage en réhydratant tranches de gel séchées avec la quantité minimale de solution de trypsine porcine (12,5 ng / ul dans 0,025 M de bicarbonate d&#39;ammonium aqueux) pendant 16 heures à 37 ° C. </li><li> Ajouter de l&#39;eau de 10 pi de tranche de gel et incuber pendant 15 min à 37 ° C. Ajouter 80 ul d&#39;acétonitrile et incuber pendant 15 min à 37 ° C. Centrifuger à 15 800 xg, pendant 1 min. Recueillir surnageant et conserver dans un séparées 0,6 mltube. </li><li> Ajouter 65 pi de 5% d&#39;acide formique solution, vortex et incuber pendant 15 min à 37 ° C. Ajouter 65 ul d&#39;acétonitrile et incuber pendant 15 min à 37 ° C. Centrifuger à 15 800 g pendant 1 min. Récupérer le surnageant et ajouter au surnageant provenant de l&#39;étape précédente. On évapore le produit surnageant combiné à siccité dans un concentrateur sous vide. </li></ol></li><li> Les tumeurs solides. <ol><li> Pour éliminer le SDS de lysat de tissu utiliser le protocole FASP suivante, également décrit comme dans la référence 15. </li><li> Après la première centrifugation décrit dans l&#39;étape 5.2.3 ajouter encore 200 ul d&#39;urée 8 M sur le filtre, et en outre centrifuger à 14 000 xg pendant 20 min à 20 ° C. Jeter le filtrat de accréditives. </li><li> Ajouter 100 ul IAA et mélanger dans un thermomixer à 600 rpm pendant 1 min. Incuber le filtre pendant 20 min à 20 ° C dans l&#39;obscurité. Centrifuger le filtre à 14 000 xg pendant 10 min à 20 ° C. </li><li> Ajouter 100 ul d&#39;urée au filtre et centrifuge à 14 000 x g, pendant 15 min à 20 ° C. Répétez cette étape une fois de plus. </li><li> Ajouter 100 ul de NH 4 HCO 3 pour le filtrage et centrifugation à 14 000 xg pendant 10 min à 20 ° C. Répéter deux fois cette étape. </li><li> Ajouter 40 ul NH 4 HCO 3 + 1 pi (= 0,4 ug) trypsine et mélanger dans thermomixer à 20 ° C pendant 600 tours, 1 min. Incuber le filtre O / N dans une chambre humide à 37 ° C. Transférer le filtre à de nouveaux tubes de prélèvement. </li><li> Centrifuger le filtre à 14 000 xg pendant 10 min à 20 ° C. Ajouter 50 pi de NH 4 HCO 3 et centrifuger les filtres à 14000 g pendant 10 min à 20 ° C. Conserver les peptides résultant à -20 ° C jusqu&#39;à la mesure de spectrométrie de masse. </li><li> Pour la mesure de la concentration de peptide, 50 ul de distribuer le flux continu résultante et une série de dilutions appropriées de tryptophane pur dans une plaque à 96 puits. Mesurer la fluorescence du tryptophane. Convertir la concentration résultante detryptophane à la concentration de peptide, comme 0,1 pg de tryptophane correspond à 9 ug de protéine. </li></ol></li></ol> Analyse 6. chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse <ol><li> Reprendre peptides dans un tampon de charge 30 pi de 5 min dans un bain de sonication. Isoler dans une centrifugeuse à 15 800 g pendant 1 min et pipette la solution claire dans un flacon de MS échantillonneur automatique. </li><li> Injecter 5 ul d&#39;échantillon par analyse à l&#39;aide de l&#39;échantillonneur automatique du système nanoLC-MS / MS. Concentrer et dessaler peptides en ligne sur une phase inversée C18 pré-colonne (0,15 mm ID x 20 mm avec 5 um taille des pores matériau C18) soit monté dans une configuration de colonne ventilé ou une configuration de pré-colonne de commutation. </li><li> Peptides séparés sur un C18 microcolonne en phase inverse (0,075 mm de DI x 200 mm auto-garnie de 3 pm ou plus petit pore matériau taille de C18 dans une colonne de nanospray auto-paquet comme PicoFrit, en utilisant un gradient de 90 min de 5&gt; 35% d&#39;acétonitrile vs . acide formique aqueux à 0,1% à 300 nl /min. Transfert éluant en un hybride quadripôle / spectromètre de masse Orbitrap par une source nanospray d&#39;ions. </li><li> Analyser peptides en utilisant une méthode Top15 des données dépend d&#39;acquisition (MS m / z de gamme 350 -. 1600, la résolution cible 70,000 FWHM, AGC cible 1 x 10 6, max temps de remplissage de 60 msec MS / MS départ de masse 100, la résolution cible 17,500 FWHM, AGC cibler 2 x 10 5, temps de remplissage max 60 ms MS / MS seuil 3 x 10 4, comprennent des états facturer 2 -. 5, normalisé énergie de collision NCE 25%, dynamique exclusion 15 sec). </li></ol> 7. Analyse des données <ol><li> Pour l&#39;analyse de données d&#39;utiliser le logiciel MaxQuant 16 disponible gratuitement. Un protocole détaillé pour l&#39;analyse de données bioinformatique est décrite dans 16,17. Pour l&#39;analyse, de combiner des fichiers de données brutes de toutes les tranches à partir d&#39;un SDS-PAGE voies en une seule expérience 17. </li></ol>

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Les auteurs ne ont aucun conflit d&#39;intérêts ou d&#39;autres questions de divulguer.

Spectrométrie de masse profilage des protéomes des cellules cancéreuses provenant de patients est nécessaire pour la découverte de nouveaux biomarqueurs de diagnostic / prédictifs ainsi que de donner une meilleure compréhension de la biologie des cellules cancéreuses, ce qui pourrait à son tour conduire à l&#39;identification de nouvelles cibles potentielles de médicaments. Cependant, ces analyses spectrométrie de masse sont très difficile, notamment en raison de diverses questions pré-analytiques doivent être résolus, si l&#39;on veut obtenir des résultats robustes et biologiquement pertinents. Le flux de travail expérimental décrit ici permet la caractérisation protéomique quantitative des protéomes sous-populations cellulaires dérivées de tumeurs à la fois liquides et solides. L&#39;enrichissement initial des cellules tumorales, soit par FACS sur la base de cellule de microdissection sortingor est nécessaire pour éviter la contamination par des cellules du micro-environnement de la tumeur. En outre, ces techniques permettent d&#39;isoler les sous-populations cellulaires d&#39;intérêt. Études de cellules biologiques récentes ont démontré que certaines sous-populations cellulaires ont des propriétés initiatrices de tumeurs et sont donc très pertinent pour la pathogenèse du cancer 19,20. Comme la spectrométrie de masse est devenue plus sensible au cours des dernières années, des analyses quantitatives protéomiques sont réalisables pour les petites quantités de protéines qui peuvent être tirés de quelques milliers de cellules, ce qui permet de se concentrer sur des populations de cellules fonctionnellement pertinents. Le set-up présenté ici peut être utilisé pour identifier et valider de nouveaux biomarqueurs de diagnostic dans des échantillons FFPE. Par conséquent, il promet à Bea outil utile pour l&#39;amélioration des diagnostics cliniques, à ce jour, il ya encore un manque de biomarqueurs moléculaires en nombre et en qualité suffisante pour de nombreux types de cancer. Des exemples importants de diagnostics différentiels difficiles, pour lesquels biomarqueurs font défaut, sont la discrimination entre cancer du poumon primaire à partir de métastases dans le poumon, le carcinome cholangiocellulaires intrapancréatique et adénocarcinome pancréatique, ainsi que diffèrentciation du neurofibrome bénigne de tumeurs malignes périphériques très nerveux gaine. En outre, nous et d&#39;autres avons montré que l&#39;élucidation quantitative des signatures protéomiques peut être utile dans l&#39;étude de biologie des cellules cancéreuses en général, et pour révéler biomarqueurs prédictifs de la réponse thérapeutique chez les patients cancéreux 21. Deux inconvénients actuels de la méthode présentée ici sont l&#39;exigence d&#39;une vaste traitement manuel de l&#39;échantillon et la demande sur le nanoLC-MS / MS temps d&#39;acquisition. Alors que le premier peut être adressée en déplaçant la préparation des échantillons à par exemple, les formats de 96 puits et en utilisant un traitement robotique, ce dernier exigera un changement dans la stratégie d&#39;acquisition de spectrométrie de masse. Une fois que les sous-ensembles de protéines cibles ont été identifiés qui peuvent être associées avec, par exemple, la classification de la tumeur, nous envisageons la conception des procédés de spectrométrie de masse ciblés qui fournissent des lectures quantitatives pour ces sous-ensembles avec un effort de séparation fortement réduite, etdonc avec un temps d&#39;acquisition réduit en conséquence. Si le temps d&#39;acquisition requis requis pourrait être réduit de 24 à 36 h (tumeurs liquides) ou 3 heures (tumeurs solides) pour, par exemple, 1 heure par spectrométrie de masse et un simple séparation unidimensionnelle de peptides, le gain résultant du débit ciblé pourrait être utilisé pour augmenter de manière significative le nombre de répétitions biologiques et techniques examinés, avec des améliorations correspondantes dans la signification des résultats de quantification. Approches de spectrométrie de masse ciblées ont déjà été démontré être un outil approprié pour la vérification de cancer associé protéines biomarqueurs candidats-22, et ont été développés à un point où ils sont prometteurs pour la validation ou même comme un outil potentiel pour une utilisation clinique de routine 23 , 24.

Protéomique par spectrométrie de masse a vu le jour et est maintenant une discipline largement utilisé en biologie cellulaire et de la recherche biomédicale translationnelle. Les progrès techniques dans le domaine ont permis d&#39;étudier les processus cellulaires complexes dans des lignées cellulaires et des modèles animaux, que des milliers de protéines peuvent être identifiées dans une seule expérience de spectrométrie de masse 1,2. Des progrès similaires ont été réalisés pour l&#39;analyse de nombreuses modifications post-traductionnelles comme la phosphorylation ou ubiquitination, bien que cela nécessite généralement workflows sur mesure pour l&#39;enrichissement et l&#39;analyse de données pour chaque type de modification 2,3. En outre, la participation des stratégies d&#39;étiquetage chimiques et métaboliques, y compris SILAC, permet une quantification précise et relative de protéines et de PTM, ce qui rend cette méthode particulièrement intéressante pour la découverte des processus cellulaires de base, biomarqueurs diagnostiques et cibles potentielles de médicaments dans le cancer humain 4. Cependant,plusieurs défis doivent être surmontés à l&#39;égard de l&#39;analyse protéomique des cancers humains primaires 5. Tout d&#39;abord, des échantillons de cancer humain présentent souvent un degré élevé d&#39;hétérogénéité cellulaire qui est due à la présence de divers types de cellules appartenant au micro-environnement de la tumeur, y compris les cellules immunitaires et les fibroblastes. Deuxièmement, l&#39;évolution clonale conduit à la diversité génétique dans les tumeurs elles-mêmes, ce qui entraîne l&#39;existence de plusieurs sous-populations cellulaires ayant des propriétés fonctionnelles distinctes. Selon le concept actuel de quelques cellules souches du cancer étant les forces motrices derrière le développement du cancer et la progression, analyse protéomique de ces sous-populations cellulaires (fonctionnellement très pertinents) devrait être d&#39;une importance majeure pour une meilleure compréhension des mécanismes oncogéniques pertinentes pour l&#39;application clinique 6. En troisième lieu, les profils d&#39;expression de protéines quantitatives de grandes séries d&#39;échantillons sont souvent nécessaires pour l&#39;identification du solide clinique BiomarKERS; cela ne peut être accompli par l&#39;étiquetage des produits chimiques tels que iTRAQ 7, tandis que les stratégies de marquage métabolique - se appuyant, comme ils le font, sur la prolifération cellulaire 4 - sont également inapplicable. En quatrième lieu, la plupart des échantillons de tumeurs solides disponibles sont fixés à la formaline, ce qui complique l&#39;analyse spectrométrique de masse du protéome due à la formation de reticulations de protéines 8. Enfin, la plupart des workflows existants protéomique nécessitent des quantités importantes de traitement des échantillons et d&#39;acquisition de données, ce qui rend l&#39;analyse des numéros d&#39;échantillons pertinents pour la recherche clinique difficile, et appelant à nouveau workflow paradigmes de 9,10. Pour surmonter ces obstacles, nous avons développé un dispositif expérimental qui combine soit cellule de cytométrie en flux de tri 11 ou laser capture microdissection 12,13 pour l&#39;enrichissement cellulaire avec une stratégie Super-SILAC 14 d&#39;introduire une norme globale interne pour l&#39;analyse par spectrométrie de masse globale. En utilisant le procédé décrit ici, il est possible de quantifier jusqu&#39;à 8000 protéines dans des échantillons de tumeurs humaines simples dérivées de cancers solides ou liquides.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="943">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:181px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">660 nm Kit</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td style="width:151px;">22662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture medium depleted of arginine and lysine</td>
			<td style="width:181px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">88421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 staining solution</td>
			<td style="width:181px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:151px;">161-0436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dialyzed fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:181px;">PAA</td>
			<td style="width:151px;">A15-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diffuser caps for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS-sorter</td>
			<td style="width:181px;">BD</td>
			<td style="width:151px;">FACSAria III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ionic Detergent Compatibility Reagent</td>
			<td style="width:181px;">Thermo scientific</td>
			<td>22663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser-capture microdissector</td>
			<td style="width:181px;">MMI&#160;</td>
			<td style="width:151px;">cell cut plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LDS buffer&#160;</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane slides for microdissection</td>
			<td style="width:181px;">MMI</td>
			<td style="width:151px;">50103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcon YM-30</td>
			<td style="width:181px;">Millipore</td>
			<td style="width:151px;">MRCF0R030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NuPAGE 4-12% Bis-Tris Mini Gels</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:151px;">NP0335PK2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Picofrit Self-Pack Columns</td>
			<td style="width:181px;">New Objective</td>
			<td style="width:151px;">PF360-75-15-N-5</td>
			<td>Mass Spectrometry Column/Emitter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reducing agent</td>
			<td style="width:181px;">Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Column stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 3 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Reprosil-Pur LC/MS/MS Precolumn stationary phase</td>
			<td style="width:181px;">Dr. Maisch</td>
			<td style="width:151px;">120 C18-AQ, 5 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled arginine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">CLM-2265-H-0.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SILAC-labeled lysine</td>
			<td style="width:181px;">Eurisotop</td>
			<td style="width:151px;">DLM-2640-0.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, NB Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Serva</td>
			<td style="width:151px;">3728301</td>
			<td>for in-gel digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin, Sequencing Grade</td>
			<td style="width:181px;">Promega</td>
			<td style="width:151px;">V5111</td>
			<td>for in-solution digests</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buffer and solutions</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;">Cell lysis buffer: 150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl pH 7.8, 5mM NaF,&#160; 0,5% NP40, 0.1% laurylmaltoside, Roche complete protease inhibitor, 1 mM Na3VO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Tissue lysis buffer: 100 mM Tris/HCl pH 7.8, 0.1 M DTT&#160;</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Urea: 8 M urea in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IAA: 0.05 M iodoacetamide, 8 M urea, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for FASP-protocoll</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">0.05 M NH4HCO3</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mM dithiothreitol (DTT) in 0.1 M ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">55 mM iodoacetamide (IAA) in 0.1 mM ammonium bicarbonate</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>for in-gel digest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;5% aqueous formic acid.</td>
			<td style="width:181px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative mass spectrometric profiling of cancer-cell proteomes derived from liquid and solid tumors

Des analyses approfondies des protéomes cellulaires de cancer sont nécessaires pour élucider pathomécanismes oncogènes, ainsi que d&#39;identifier des cibles potentielles de médicaments et de biomarqueurs de diagnostic. Cependant, les méthodes de caractérisation protéomique quantitative des tumeurs provenant de patients et en particulier leurs sous-populations cellulaires font largement défaut. Nous décrivons ici un montage expérimental qui permet l&#39;analyse quantitative des protéomes de sous-populations de cellules cancéreuses dérivées de soit des tumeurs liquides ou solides. Ceci est réalisé par la combinaison des stratégies d&#39;enrichissement cellulaire avec la spectrométrie de masse à base de Super-SILAC quantitative suivie d&#39;analyse bioinformatique des données. Pour enrichir sous-ensembles cellulaires spécifiques, tumeurs liquides sont d&#39;abord immunophénotypés par cytométrie de flux suivie par FACS-tri; des tumeurs solides, microdissection par capture laser est utilisé pour purifier des sous-populations cellulaires spécifiques. Dans une deuxième étape, les protéines sont extraites à partir des cellules purifiées et ensuite combinés avec un spécifique d&#39;une tumeur,SILAC marqué norme de pic-in qui permet la quantification des protéines. Le mélange de protéine ainsi obtenu est soumis à une électrophorèse sur gel ou l&#39;autre filtre ou assistée Préparation d&#39;échantillons (FASP) suivie d&#39;une digestion trypsique. Enfin, les peptides tryptiques sont analysés en utilisant un spectromètre de masse quadripolaire Orbitrap-hybride, et les données obtenues sont traitées avec des suites de logiciels bioinformatiques y compris MaxQuant. Par le biais du flux de production présentée ici, jusqu&#39;à 8000 protéines peuvent être identifiés et quantifiés dans les échantillons de patients dérivés, et les profils d&#39;expression de protéines qui en résultent peuvent être comparés chez les patients pour identifier les signatures protéomiques de diagnostic ou de cibles potentielles de médicaments.

Profilage protéomique des tumeurs liquides et solides provenant de patients est une approche prometteuse pour la découverte de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et prédictives. Toutefois, la procédure de préparation d&#39;échantillon et l&#39;analyse par spectrométrie de masse sont difficiles en raison de la complexité des échantillons, et la nécessité d&#39;une quantification précise de la protéine en grandes séries d&#39;échantillons. Le procédé expérimental décrit ci-dessus commence avec l&#39;isolement de cellules d&#39;intérêt, soit par tri cellulaire activé par fluorescence ou par microdissection par capture laser. A cette fin, des cellules provenant des aspirats de moelle osseuse provenant de patients ou d&#39;échantillons de sang sont colorées avec des anticorps marqués par fluorescence contre des marqueurs de surface d&#39;intérêt définies avant le triage FACS et à base de lyse des cellules. Pour enrichir des sous-ensembles cellulaires provenant des coupes de tissus, ceux-ci doivent d&#39;abord être monté sur des glissières appropriées pour permettre au laser capture microdissection. A cet effet, monter til coupes de tissus sur les lames de membranes appropriées et utilisent un laser capture microdissecteur selon les instructions du fabricant. Sélection des zones et des cellules d&#39;intérêt exige une connaissance appropriée de la histomorphologie des tissus sains et néoplasiques. Les cellules extraites sont ensuite transférés dans un tube de collecte approprié. Des expériences initiales doivent être effectuées afin de définir la quantité de tissu nécessaire pour l&#39;extraction de quantités suffisantes de protéine (10 ug de protéine totale minimale) pour chaque nouveau tissu d&#39;intérêt. Chaque échantillon est traité par microdissection 60 ul de tampon de lyse tissulaire. Pour la lyse efficace des cellules provenant d&#39;échantillons de tissus doivent être soumis à une sonication pendant 3 minutes et après addition de 15 ul de SDS échantillons sont incubés dans un Thermomixer à 99 ° C pendant 1 heure pour éliminer des reticulations de protéines induite par la formaline. Centrifugation va enfin faciliter la collecte du lysat cellulaire autorisé. Pour chaque maladie de intérêt (liquide et tumeurs solides) une norme de quantification Super-SILAC approprié doit être mis en place 14. Une norme appropriée devrait représenter plus de 90% des protéines exprimées dans les échantillons d&#39;intérêt. Pour la préparation d&#39;un étalon de quantification, les lignées cellulaires liés au type de cancer intérêt doivent d&#39;abord être analysés par spectrométrie de masse pour déterminer leurs profils d&#39;expression de protéine et ensuite analyse en composantes principales doivent être effectués. 4-6 lignes différentes de cellules avec des motifs d&#39;expression de protéines différencié devraient être choisis et SILAC-étiquetés avec de l&#39;arginine et la lysine &quot;lourd&quot;. l&#39;efficacité de l&#39;étiquetage doit être vérifiée par nanoLC-MS / MS et doit être supérieure à 98%. Ensuite, les lignées cellulaires doivent être lysées de la même manière que l&#39;échantillon dérivé du patient respectif et, par la suite, des quantités équimolaires de protéine de chaque échantillon et de l&#39;étalon de pic-à SILAC doivent être mélangés. Une étape cruciale pour la quantification précise de protéines des échantillons cliniques ointérêt de f est le mélange précis des quantités de protéines équimolaires des échantillons provenant de patients et la norme de quantification de SILAC pic-in. Pour déterminer la concentration de protéine de lysats provenant de cellules triées, divers dosages de quantification de protéine peuvent être utilisés. Pour lysats cellulaires à partir de cellules dérivées de tissu un test est nécessaire, qui peut faire face à de fortes concentrations de SDS et DTT dans le lysat. Les concentrations de protéines des échantillons de patients dérivés et le niveau de pic en SILAC doivent être mesurés à chaque fois avant la combinaison avec les échantillons cliniques respectives afin d&#39;assurer mélange correct, ce qui est crucial dans la fabrication même des centaines d&#39;échantillons comparables. Après que le mélange de quantités égales de pointe dans des échantillons standards et de lysat, obtenus à partir de tumeurs liquides sont mélangés avec des LDS, réchauffées dans un Thermomixer à 72 ° C pendant 10 min et ensuite soumis à 1D-PAGE et en gel de la digestion séparés les protéines avec de la trypsine. Les échantillons obtenus à partir detissus sont libérés du SDS et digérée par la trypsine en utilisant l&#39;approche de FASP établi par Wisniewski et al. 15 Les peptides trypsiques obtenus peuvent être quantifiés en mesurant la fluorescence du tryptophane, ce qui est d&#39;un intérêt particulier pour des échantillons de tissu que la quantité de peptides libérés à partir du filtre diffère entre 15% et 75% par rapport aux quantités de protéines initialement chargées sur le filtre. A cet effet, nous mesurons la fluorescence du tryptophane. La comparaison avec une série de dilutions de tryptophane permet approprié pour la quantification de peptides, comme 1,1 pg de tryptophane correspond à environ 100 ug de peptide. Si nécessaire, des échantillons provenant en particulier de la transformation du FASP peuvent être pré-purifiés soit sur ​​des conseils de la scène commerciale ou faits maison emballés avec (RP-C18) matériau à phase inversée C18 avant de charger sur le système nanoLC / MS / MS 18. analyse par spectrométrie de masse est effectuée sur une grande-résolution, haute sensibilité système spectrométrie de masse. En bref, des échantillons de peptides sont dessalés et préconcentrées sur une pré-colonne RP-C18, et on les sépare sur une colonne analytique RP-C18 couplé directement au spectromètre de masse. Pour atteindre une profondeur suffisante de l&#39;analyse, nous employons soit une combinaison de SDS-PAGE protéines préfractionnement 40 min gradients RP-C18 (pour les tumeurs liquides) ou des injections uniques avec de longues 2-3 h gradients RP-C18 (pour les tumeurs solides traitées par FASP ). MS spectres sont acquis avec une résolution de 70 000 FWHM ou mieux, pour permettre une quantification précise de paires SILAC par intégration des pics des profils chromatographiques. Pour l&#39;identification de la protéine, un procédé d&#39;acquisition de données dépendant Top15 est utilisée pour générer un grand nombre de peptide spectres MS / MS pour l&#39;identification des peptides et des protéines. A partir des données brutes résultant, l&#39;identification et la quantification de protéines sont atteints par la base de données avec le logiciel recherche MaxQuant contre un UniProt Knowledgebase Human base de données de séquence complète du protéome 17. Dans MaxQuant logiciel (version actuelle 1.5.0.25) peptides sont identifiés à partir de la spectres MS / MS acquis par fragment peptidique correspondant pas aux spectres dérivé in silico à partir de la base de données de séquences de protéines. Dans le même temps, ion précurseur profils isotopiques sont extraites autour de leurs temps de rétention chromatographiques et leurs domaines de pointe intégrées sont utilisées pour la quantification relative de la lumière: paires lourds peptidiques générés par étiquetage SILAC. Peptide identités et les intensités relatives sont ensuite affectés aux propriétés des protéines correspondantes. Logiciel Persée (version actuelle 1.5.0.15) est ensuite utilisé pour effectuer une évaluation plus approfondie statistiques aval des résultats de traitement de MaxQuant, y compris l&#39;échantillon-à-échantillon comparaisons, PCA et classification hiérarchique. Utilisation du dispositif expérimental décrit, nous avons identifié et quantifié jusqu&#39;à 8000 protéines d&#39;aussi peu que 30 ug de protéine totaledérivé de tumeurs liquides. Jusqu&#39;à 2500 protéines à partir d&#39;échantillons solides tumorales peuvent être identifiés et quantifiés dans une approche protéomique fusil de chasse avec un gradient de LC de seulement 2 heures, ce qui permet l&#39;analyse de centaines d&#39;échantillons cliniques dans un temps relativement court. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig1highres.jpg" /> Figure 1. de workflow expérimentale. Les principales étapes de l&#39;enrichissement cellulaire sous-ensemble, l&#39;isolement des protéines, pic-in de la norme de quantification et l&#39;analyse par spectrométrie de masse sont indiqués pour les tumeurs liquides et solides. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig2highres.jpg" /> Figure 2. cellulaire enrichissement strategies. FACS tri et LCM. (A) Des exemples de stratégie de déclenchement représentant gating sur leucémique une population de cellules CD117 teinté acquis par un trieur de cellules. (B) microdissection par capture laser du tissu de tumeur solide. Les coupes de tissus de 5 à 10 um d&#39;épaisseur ont été montées sur des lames de membrane film couverte avant la coloration. Région des intérêts a été sélectionnée manuellement pour microdissection laser. Affichés sont des sections avant microdissection avec la région d&#39;intérêt marquée en jaune et après microdissection. Une barre d&#39;échelle de 50 um est inclus dans le chiffre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52435/52435fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52435/52435fig3highres.jpg" /> Figure 3. L&#39;analyse typologique des protéomes des cellules cancéreuses humaines. Unsupervised analyse typologique des prprofils d&#39;expression otein de tumeurs solides et liquides a été réalisée en utilisant la plate-forme de calcul Persée. AC - adénocarcinome, SCC - Le carcinome épidermoïde, CSC-Met - squameuses métastases de carcinome de cellules de cancer de la tête et du cou, R - répétition technique.

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Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Spectrométrie de masse quantitative de profilage Protéomes Cancer-cellulaires dérivées de liquide et de tumeurs solides

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

quantitative-mass-spectrometric-profiling-cancer-cell-proteomes

Research

JoVE Journal

Medicine

16.0K vues.  University Medical Center, Göttingen. In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Vidéo: Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

Cartographie hétérogénéité d&#39;expression des protéines dans les tumeurs par immunofluorescence quantitative

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Recherche

Médecine

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

Détection MicroRNA dans les tumeurs prostatiques par quantitative PCR en temps réel (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Analyse quantitative des Protéomes chromatine dans la maladie

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome compared to matched normal tissue. Based on these analyses it is evident that there are many undiscovered genetic drivers of cancer1. Unfortunately these drivers are hidden within a much larger number of passenger anomalies in the genome that do not directly contribute to tumor formation. Another aspect of the cancer genome is that there is considerable genetic heterogeneity within similar tumor types. Each tumor can harbor different mutations that provide a selective advantage for tumor formation2. Performing an unbiased forward genetic screen in mice provides the tools to generate tumors and analyze their genetic composition, while reducing the background of passenger mutations. The Sleeping Beauty (SB) transposon system is one such method3. The SB system utilizes mobile vectors (transposons) that can be inserted throughout the genome by the transposase enzyme. Mutations are limited to a specific cell type through the use of a conditional transposase allele that is activated by Cre Recombinase. Many mouse lines exist that express Cre Recombinase in specific tissues. By crossing one of these lines to the conditional transposase allele (e.g. Lox-stop-Lox-SB11), the SB system is activated only in cells that express Cre Recombinase. The Cre Recombinase will excise a stop cassette that blocks expression of the transposase allele, thereby activating transposon mutagenesis within the designated cell type. An SB screen is initiated by breeding three strains of transgenic mice so that the experimental mice carry a conditional transposase allele, a concatamer of transposons, and a tissue-specific Cre Recombinase allele. These mice are allowed to age until tumors form and they become moribund. The mice are then necropsied and genomic DNA is isolated from the tumors. Next, the genomic DNA is subjected to linker-mediated-PCR (LM-PCR) that results in amplification of genomic loci containing an SB transposon. LM-PCR performed on a single tumor will result in hundreds of distinct amplicons representing the hundreds of genomic loci containing transposon insertions in a single tumor4. The transposon insertions in all tumors are analyzed and common insertion sites (CISs) are identified using an appropriate statistical method5. Genes within the CIS are highly likely to be oncogenes or tumor suppressor genes, and are considered candidate cancer genes. The advantages of using the SB system to identify candidate cancer genes are: 1) the transposon can easily be located in the genome because its sequence is known, 2) transposition can be directed to almost any cell type and 3) the transposon is capable of introducing both gain- and loss-of-function mutations6. The following protocol describes how to devise and execute a forward genetic screen using the SB transposon system to identify candidate cancer genes (Figure 1).

Identification of Sleeping Beauty Transposon Insertions in Solid Tumors using Linker-mediated PCR

A method of identifying unknown drivers of carcinogenesis using an unbiased approach is described. The method uses the Sleeping Beauty transposon as a random mutagen directed to specific tissues. Genomic mapping of transposon insertions that drive tumor formation identifies novel oncogenes and tumor suppressor genes

Identification des<em&gt; Belle au Bois Dormant</em&gt; Insertions de transposons dans les tumeurs solides en utilisant l&#39;éditeur de liens médiée par PCR

Genomic, proteomic, transcriptomic, and epigenomic analyses of human tumors indicate that there are thousands of anomalies within each cancer genome ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquide céphalo-rachidien profilage de microARN Utilisation quantitative PCR en temps réel

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo L&#39;imagerie optique de tumeurs cérébrales et l&#39;arthrite Utilisation fluorescent SAPC-DOPS nanovésicules

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Méthode pour l&#39;obtention de cellules cancéreuses ovariennes primaires à partir d&#39;échantillons solides

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Génération de microtumeurs Utilisation 3D Biogel humain Système de culture et les cellules de glioblastome patients dérivés pour Kinomic Profilage et Testing Réponse Drug

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

L&#39;isolement et le profilage des exosomes de Bile humain contenant microARN-

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Spatial Measurements of Perfusion, Interstitial Fluid Pressure and Liposomes Accumulation in Solid Tumors

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes is a critical determinant of their efficacy. Both the chaotic tumor microcirculation and elevated IFP are linked to the heterogeneous intra-tumoral distribution of nanotechnology-based drug delivery systems such as liposomes. In the present study, the relationship between tumor microcirculation, elevated IFP, and accumulation of nanoparticles was investigated through in vivo experimentation. This was accomplished by evaluation of the tumor microcirculation using dynamic contrast enhanced computed tomography (DCE-CT) and measurement of tumor IFP using a novel image-guided robotic needle placement system connected to the micro-CT scanner. The intra-tumoral accumulation of liposomes was determined by CT image-based assessment of a nanoparticle liposomal formulation that stably encapsulate the contrast agent iohexol (CT-liposomes). CT imaging allowed for co-localization of the spatial distribution of tumor hemodynamics, IFP and CT-liposome accumulation in an individual subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer. Measurements led to the discovery that perfusion and plasma volume fraction are strong mediators of the intra-tumoral distribution of liposomes. Furthermore, the results suggest that IFP plays an indirect role in mediating liposome distribution through modulating blood flow.

The heterogeneous intra-tumoral accumulation of liposomes has been linked to an abnormal tumor microenvironment. Herein methods are presented to measure tumor microcirculation by perfusion imaging and elevated interstitial fluid pressure (IFP) using an image-guided robotic system. Measurements are compared to the intra-tumoral accumulation of liposomes, determined using volumetric micro-CT imaging.