L’imagerie intravitale nous permet d’observer les interactions physiologiques au sein du microenvironnement tumoral. Et en utilisant cette méthode, les comportements dynamiques spécifiques observés peuvent être compartimentés à l’aide de caractéristiques tissulaires locales. Ce protocole utilise uniquement un signal omniprésent sans étiquette provenant de fibres de collagène ou de métabolites autofluorescents pour segmenter le TME, minimisant ainsi la quantité de manipulations à la souris.
Cette méthode est largement applicable à tout système intravital où la compréhension des interactions dynamiques relatives aux structures de matrice extracellulaire ou aux structures vasculaires est nécessaire. Dave Inman, spécialiste principal de la recherche, et Erica Hoffmann, étudiante diplômée du laboratoire, feront la démonstration de cette procédure. Commencez à préparer un verre de couvre-fenêtre d’imagerie mammaire en trempant un verre de couverture ronde de 1,5 12 millimètre dans de l’éthanol à 100% pendant 10 minutes, puis séchez le verre de couverture sous une lampe chauffante et fixez le verre au cadre de fenêtre d’imagerie mammaire en métal à l’aide d’un adhésif cyanoacrylate.
Durcissez l’adhésif pendant la nuit. Le lendemain, utilisez un écouvillon imbibé d’acétone pour nettoyer la fenêtre d’imagerie mammaire assemblée de l’excès d’adhésif avant d’immerger la fenêtre d’imagerie mammaire dans de l’éthanol à 70% pendant au moins 10 minutes pour faciliter le nettoyage. Après séchage, conservez la fenêtre d’imagerie mammaire nettoyée dans une boîte de Petri stérile.
Avant de commencer la chirurgie pour l’implantation de la fenêtre, autoclavez les outils chirurgicaux et désinfectez les surfaces avec de l’éthanol à 70%. Préparez une table désinfectée pour la chirurgie avec une couverture chauffante recouverte d’un champ stérile. Réglez la couverture chauffante de telle sorte que la température mesurée au-dessus du champ stérile soit de 40 degrés Celsius.
Utilisez un éclairage froid auxiliaire et des loupes pour l’intervention chirurgicale. Portez un EPI composé d’une blouse de laboratoire stérile à usage unique, de manches chirurgicales, de gants, d’une protection oculaire et d’un masque facial. Ensuite, retirez la fourrure de la souris anesthésiée au niveau de la quatrième glande mammaire inguinale avec une crème dépilatoire et rincez le site chirurgical avec une gaze stérile imbibée d’eau.
Ensuite, préparez le site chirurgical épilé pour la chirurgie en désinfectant la surface de la peau avec trois gommages alternés à la bétadine et à l’éthanol. Lorsque cela est fait, soulevez doucement la peau sur la glande mammaire numéro quatre à l’aide d’une pince. Une fois que la peau est retirée de la paroi corporelle, retirez une section d’un millimètre de la couche dermique à l’extrémité de la pince avec des microcisseurs chirurgicaux.
Sans couper la glande sous-jacente, créez une incision de 10 millimètres, puis libérez la glande mammaire de la couche dermique avec le mouvement doux de la pince. Ajouter PBS pour couvrir la glande exposée. Utilisez une suture tressée en soie 5-0 pour créer une suture de cordon de bourse le long de la périphérie de l’ouverture, puis insérez un bord de la fenêtre d’imagerie mammaire afin que la couche dermique s’engage dans l’encoche réceptrice de la fenêtre d’imagerie mammaire.
Tout en étirant l’épithélium à l’extrémité opposée de la fenêtre d’imagerie mammaire, poussez la fenêtre d’imagerie mammaire métallique en place de sorte que la couche dermique engage pleinement l’encoche réceptrice autour de toute la circonférence de la fenêtre d’imagerie mammaire. Ensuite, pincez le cordon de la bourse pour dessiner la couche dermique dans l’encoche et attachez la couche pour fixer la fenêtre. Appliquez un antibiotique topique sur la couche dermique à la fenêtre d’imagerie mammaire et surveillez en permanence la souris.
Après avoir repris suffisamment de conscience pour maintenir la position couchée sternale, logez la souris implantée de fenêtre d’imagerie mammaire séparément sur une literie souple avec un igloo placé dans la cage et laissez la souris récupérer pendant 48 heures avant l’imagerie. Pour l’imagerie, utilisez un système d’air forcé réglé à 30 degrés Celsius. Utilisez un réchauffeur d’objectif supplémentaire pour éviter la dérive dans la mise au point Z et permettre au système de s’équilibrer à 30 degrés Celsius pendant au moins une heure avant l’imagerie.
Ensuite, installez une chambre de chauffage sur la scène du microscope. Après avoir confirmé l’anesthésie avec la méthode de pincement des orteils, ajoutez une pommade pour les yeux à la souris. Pour maintenir une bonne hydratation, injecter 0,5 millilitre de PBS par voie sous-cutanée toutes les deux heures pendant toute la durée de la séance d’imagerie.
Appliquez un gel à base d’eau au lieu d’eau sur l’objectif et nettoyez l’extérieur de la vitre d’imagerie mammaire avec un applicateur en coton et un nettoyant pour vitres avant de transférer la souris à l’étage de microscope préchauffé. Après avoir posé la souris sur l’étage du microscope, appuyez sur le collier de la fenêtre d’imagerie mammaire dans un trou de réception de 14 millimètres dans l’insert de la scène pour stabiliser les images et ajuster le tuyau d’isoflurane. Ensuite, mettez le champ d’imagerie au point à l’aide des oculaires du microscope et de l’éclairage Brightfield, en observant le flux vasculaire avec le flux sanguin.
Vérifiez la stabilité du champ de vision. Si des artefacts de mouvement respiratoire sont présents, appliquez une compression douce à l’arrière de la glande avec un petit bloc de mousse et un morceau de ruban adhésif ressemblant à de la teinture. Après l’application de la compression, vérifiez que le flux sanguin est maintenu dans tout le champ de vision.
Une fois que la souris est sous sédation et solidement positionnée sur l’étage du microscope inversé, commencez à localiser les régions d’intérêt. À l’aide d’une source lumineuse dirigée vers la fenêtre d’imagerie mammaire, utilisez les oculaires du microscope pour identifier les zones potentielles d’investigation. L’accent devrait être mis sur la vision du système vasculaire et du flux sanguin.
Ajoutez et enregistrez les positions XY dans le logiciel. Lorsque les niveaux de puissance appropriés sont définis, installez la pile Z et observez l’apparition de fibres de collagène abondantes à 20 à 50 micromètres sous la surface vitrée de la fenêtre d’imagerie mammaire. Le collagène deviendra moins répandu à mesure que le microscope s’enfoncera plus profondément dans la tumeur.
Les vides de la deuxième génération harmonique ou SHG révèlent l’emplacement des masses tumorales. Placez la tranche Z supérieure sous la couche de cellules solitaires avec les premières fibres de collagène apparaissant à 50 à 100 microns. Réglez la tranche Z inférieure à 250 micromètres où les fibres s’estompent et où le mauvais signal domine.
Répétez ensuite la procédure pour toutes les positions XY enregistrées. Une fois la plage de pile Z définie, augmentez le temps de séjour à huit microsecondes et optimisez les paramètres de puissance et de détection. Optimisez les niveaux de puissance nécessaires pour exciter le tissu pour chaque expérience et utilisez des puissances allant jusqu’à 90 milliwatts à 750 nanomètres ou 70 milliwatts à 890 nanomètres à l’ouverture arrière de l’objectif.
Ensuite, commencez par des intervalles de 10 minutes entre les points de collecte pour la plupart des films de migration intravitale et ajustez les intervalles de temps en fonction des objectifs expérimentaux. Si des signes de phototoxicité tels que des bêlements cellulaires ou une autofluorescence en augmentation rapide et un photoblanchiment excessif sont observés, réduisez la puissance du laser ou augmentez les intervalles de timelapse selon les conditions. Pour l’imagerie à vie de fluorescence ou FLIM du NADPH, commencez à prévisualiser le balayage et ajustez la puissance du laser jusqu’à ce que la lecture du discriminateur de fraction constante ou CFD soit comprise entre 10 et 10 pour le sixième.
Dépasser la CFD au-delà de 10 à la sixième entraîne un empilement de photons et de mauvais résultats globaux. Une fois le niveau de puissance réglé, réglez le temps d’intégration entre 90 et 120 secondes et démarrez la collection FLIM pour acquérir des photons du champ de vision pendant le temps imparti. Un champ de vision typique dans une tumeur mammaire sans étiquette a démontré des fibres de collagène abondantes près de la fenêtre et une diminution de l’abondance plus profondément dans la tumeur.
L’utilisation de la durée de vie de fluorescence ou NADPH a aidé à l’identification du système vasculaire. Certaines régions sombres dans les images étaient des plis tumoraux ou le butting des lobes tumoraux adjacents. Pour identifier la vascularisation, une image composite utilisant NDPH FLIM a été validée en comparant les projections d’intensité maximale de la pile intravitale avant et après l’injection de dextran fluorescent dans la veine caudale.
L’analyse représentative montre la quantification de quatre souris et les champs de vision. Pour délimiter les limites des masses tumorales sans étiquette, l’autofluorescence du NADPH a été utilisée. Les images ont rapporté les signatures métaboliques des cellules et l’emplacement des vaisseaux sanguins.
L’autofluorescence de l’AFD a également identifié les macrophages. Avec le schéma de segmentation, la tumeur sans étiquette a été segmentée en compartiments pour le nid tumoral, le stroma et le système vasculaire en utilisant uniquement l’autofluorescence SHG et NADPH. De plus, les fibres de stroma et de collagène peuvent également être classées en régions locales des fibres alignées.
La chose la plus importante à retenir pour ce protocole est de s’assurer que la souris est correctement sous sédation et retenue afin que le champ de vision reste stable pour l’imagerie.
