Le comptage des unités formant colonies, ou UFC, est une technique standard en microbiologie, mais elle est lente et nécessite beaucoup de plaques de gélose. Notre technique offre un avantage cent fois supérieur aux méthodes traditionnelles de comptage de l’UFC dans les deux plaques de gélose temporelle. Nous avons appliqué la méthodologie pour mesurer le microbiome intestinal de modèles de petits animaux, en particulier les mouches des fruits.
Ce protocole est un moyen simple, rapide et automatisé de quantifier les UFC chez les mouches gnotobiotiques. Ce protocole fournit un flux de travail avec des instruments fabriqués à bricolage pour photographier les UFC et un logiciel personnalisé pour automatiser leur comptage. Ce protocole pourrait être utilisé dans n’importe quelle expérience de microbiologie où des méthodes plus efficaces de placage et de comptage de l’UFC pourraient être utiles.
Manipuler efficacement les mouches et repérer les plaques nécessite une dextérité manuelle, cela devrait donc être pratiqué. L’utilisation du logiciel de comptage automatisé nécessite un jugement sur le seuil, de sorte que les reçus doivent être comparés aux comptages manuels pour identifier les meilleurs paramètres pour votre expérience. Pour commencer, versez des perles de verre de 0,5 micron sur le plateau de mesure des perles.
Étalez les perles sur le plateau afin que tous les puits soient pleins et nivelés. Ensuite, brossez les perles en excès dans un tube conique. Maintenant, placez une plaque PCR semi-jupe à l’envers sur le plateau de mesure et alignez-la avec les puits en l’insérant dans l’indentation sur le plateau de mesure.
Ensuite, retournez-le rapidement pour transférer les perles. Enlevez les billes en excès de la surface de la plaque PCR. Assurez-vous que tous les puits contiennent des perles.
Si nécessaire, utilisez une pelle de pesée pour ajouter des perles à un seul puits. Ensuite, couvrez la plaque avec du papier d’aluminium et de l’autoclave. Avant d’utiliser la plaque, ajoutez 100 microlitres de PBS à chaque puits immédiatement avant d’ajouter les mouches à l’aide du pipetter à 96 canaux.
Pour stériliser en surface les mouches anesthésiées, transférer les mouches du flacon dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre à l’aide d’un petit entonnoir. Vaporisez immédiatement un millilitre d’éthanol à 70% dans le tube, fermez le tube et mélangez par inversion pendant 10 secondes. Ensuite, aspirez l’éthanol avec une pipette P-1000 tout en évitant d’aspirer les mouches.
Après le lavage final du PBS, fermez le tube et tapotez-le fort sur le banc plusieurs fois avec le côté du capuchon vers le bas pour que les mouches pénètrent dans le bouchon. Après avoir ouvert le tube, distribuez les mouches dans les puits à l’aide de forceps et placez une mouche dans chaque puits. Gardez les mouches anesthésiées en gardant la plaque sur de la glace pendant le chargement.
Enlevez les billes perdues près des puits, car elles peuvent briser le joint d’aluminium et causer des fuites. Assurez-vous que le côté terne de la feuille d’étanchéité est orienté vers le bas sur la plaque et que le côté brillant est orienté vers le thermosoudant. Appuyez fermement sur le thermoscellant pendant cinq secondes et polissez avec l’applicateur à main pour fixer la feuille.
Homogénéiser les mouches pendant cinq minutes. Assurez-vous que les mouches sont complètement homogénéisées et que la solution devient colorée. Pour éliminer le liquide de la feuille d’étanchéité, faites tourner la plaque de perles pendant 30 secondes dans un mini essoreuse à 350 G.Retirez la feuille tout en tenant la plaque pour éviter d’éclabousser des gouttelettes d’homogénat de mouches.
Placez trois plaques rectangulaires de croissance de gélose MRS avec leurs couvercles ouverts dans l’enceinte de biosécurité pour sécher pendant au moins 10 minutes. Préparer deux plaques de dilution en ajoutant 100 microlitres de PBS à chaque puits d’une plaque stérile de 96 puits à l’aide d’un pipetter à 96 canaux. Chargez un rack de pointes P-20 sur le pipetter à 96 canaux.
Faire une dilution de 1:10 en aspirant 11,1 microlitres d’homogénat de la plaque d’échantillonnage. Maintenant, distribuez-le dans la première plaque de dilution contenant 100 microlitres de PBS stérile par puits. Maintenir la plaque de dilution sur l’agitateur à plaques pendant 10 secondes à 600 tr/min.
Mélanger à nouveau en tuyautant de haut en bas au moins 10 fois. Transférer 11,1 microlitres de la première plaque de dilution à la deuxième plaque de dilution et répéter les étapes de mélange pour toute autre dilution. Pour repérer les plaques, chargez deux microlitres de chaque puits dans la pipette à 96 canaux.
Abaissez lentement la tête de pipette sur la plaque, en évitant de poignarder dans la gélose et assurez-vous que toutes les taches ont été distribuées. Ensuite, vérifiez que les taches liquides pénètrent rapidement dans la gélose et ne coulent pas ensemble. Répéter le processus de placage pour les plaques de dilution restantes comme décrit dans le manuscrit.
Une fois que le liquide a été complètement absorbé dans l’agar-agar, inversez les plaques et incuberez-les jusqu’à ce que les colonies aient atteint la taille optimale. Organisez les assiettes logiquement et conservez-les dans un ordre spécifique lorsque vous photographiez. Orientez-les de sorte que A1 soit dans le coin supérieur gauche pour toutes les plaques.
Après avoir retiré le couvercle de la plaque, placez la plaque sur la scène avec A1 orienté dans le coin correct. Imaginez les plaques. Transférez les images sur un ordinateur et renommez-les, y compris le nom de l’expérience, le type de support, le facteur de dilution et d’autres détails pertinents.
Organisez les images à traiter pour la quantification dans un dossier. Les noms de fichiers qui distinguent les plaques deviennent des titres de colonne pour chaque ensemble de comptes dans la feuille de calcul de sortie. Créez des sous-dossiers nommés Recadré et Reçus dans le dossier.
Ces dossiers recevront les fichiers de sortie. Maintenant, lancez le plugin Croptacular à partir d’ImageJ et cliquez sur OK pour commencer le recadrage. Une boîte de dialogue pour choisir le dossier source apparaîtra.
Cliquez sur OK. Sélectionnez le dossier source et cliquez sur Ouvrir. Ensuite, cliquez sur OK dans la boîte de dialogue pour choisir le répertoire de destination. Sélectionnez le dossier de destination et appuyez sur Ouvrir.
Si l’image est déjà droite, appuyez simplement sur Espace. Sinon, redressez l’image en traçant une ligne le long d’un bord qui doit devenir horizontal. Redessinez la ligne autant de fois que nécessaire si l’image n’apparaît pas droite.
Ensuite, dessinez une zone de délimitation pour la zone de comptage et ajustez sa taille et sa proportion jusqu’à ce que toutes les taches se trouvent dans leurs cellules. Faites glisser le curseur en dehors de la zone de limite pour actualiser la grille. Lorsque la grille semble bonne, appuyez sur Espace.
Étant donné que le plugin suppose que toutes les photos sont alignées de manière identique, assurez-vous que l’image suivante pivote automatiquement sous le même angle que la première. Si cela est exact, appuyez sur Espace pour continuer. Sinon, redressez l’image comme avant.
La grille rappelle également la même position que l’image précédente. Ajustez si nécessaire et appuyez sur Espace. Lancez Count-On-It et sélectionnez Gridiron.
Définissez l’intensité de la colonie de seuil en fonction d’une valeur d’intensité de pixels supérieure et d’une valeur d’intensité de pixels inférieure. Rendez le seuil aussi strict que possible, tout en sélectionnant toutes les colonies. Cliquez sur OK dans la boîte de dialogue Action requise lorsque le seuil est satisfaisant, puis cliquez sur OK pour continuer.
Sur la première image, l’option est donnée pour continuer ou revenir au menu de configuration. Pour poursuivre le traitement par lots, cliquez sur OK. Ensuite, sélectionnez un dossier pour conserver le tableau des reçus et des résultats. Utilisez le dossier Reçus créé précédemment.
Après la première image, les images suivantes seront par défaut au même seuil que les paramètres précédents. Cliquez sur OK pour utiliser ces paramètres ou ajuster les paramètres. Passez en revue les reçus de comptage produits par le logiciel et corrigez manuellement les erreurs de comptage.
Le plugin ImageJ est statistiquement précis, mais des erreurs se produisent. Prouvez les reçus pour examiner les valeurs aberrantes et identifier les erreurs de comptage. Le logiciel enregistre les données CFU sous forme de fichier CSV dans le même dossier que les reçus.
Pour les mouches colonisées par Lactobacillus plantarum, il y avait une diminution significative des bactéries pour les mouches qui ont été transférées quotidiennement à des aliments stériles, transférées quotidiennement, gardées sur des aliments stériles quatre heures avant l’analyse, ou transférées quotidiennement et gardées sur gélose stérile quatre heures avant l’analyse par rapport aux mouches qui n’ont jamais été transférées dans des aliments stériles après inoculation. Des résultats similaires ont été observés chez les mouches nourries à Acetobacter indonesiensis, où les mouches transférées, post-transférées et éliminées ont montré une réduction significative des UFC, mais le lavage n’a pas eu d’effet mesurable, suggérant que la réduction des UFC était due à la clairance des bactéries de l’intestin plutôt que de la cuticule. Le nombre d’UFC dans les endroits comptant de 2 à 25 colonies par endroit n’a montré aucune différence par rapport à la méthode traditionnelle.
Les taches comptant en moyenne 35 colonies présentaient des UFC inférieures à celles des plaques témoins. Cette réduction pourrait être due au chevauchement des colonies dans des endroits denses. Sur les photos de plaques, l’intensité de la colonie était 300% plus élevée que l’arrière-plan.
Les colonies de Lactobacillus plantarum mCherry-positive ont montré une intensité rouge 1 000% plus élevée que les colonies mCherry-négatives. Les colonies d’Acetobacter indonesiensis GFP positives ont montré une intensité verte 200% plus élevée que les colonies GFP négatives. Le plugin Count-On-It pour ImageJ automatise le comptage CFU à partir des photos de plaques.
Les colonies sont détectées avec précision, avec des comptages comparables au comptage manuel. Les reçus de comptage peuvent être utilisés pour identifier les erreurs de comptage. La modification des seuils de taille et des longueurs d’onde de fluorescence permet de compter séparément les différentes morphologies des colonies.
Il est essentiel de s’assurer que la plaque est bien scellée avant de perler. Il est également important de concevoir des contrôles positifs pour calibrer vos mesures. Nous utilisons également cette technique pour étudier in vitro des populations de bactéries dans des plaques de 96 puits, ce qui nous permet d’étudier des communautés mixtes de bactéries.
Cette technique permet des approches de criblage à haut débit pour mesurer la colonisation intestinale ainsi que la variation biologique de la colonisation.
