Notre protocole pour le haut débit, les cellules de levure permet le suivi de la croissance et l’expression des gènes pour des milliers de microcolonies simultanément. La différence entre les souches, entre les environnements et même entre les cellules génétiquement identiques cultivées dans un environnement partagé peut être quantifiée. Le protocole donne des estimations précises du taux de croissance moyen et de l’intensité moyenne de fluorescence des reporters d’expression génétique.
De plus, comme tant de microcolonies individuelles sont apaises, on obtient des estimations précises de distributions entières des valeurs de croissance et d’expression. Ce protocole suit deux étapes principales, la préparation de la plaque expérimentale et la préparation des cellules pour l’imagerie. Les cellules doivent être plaquées immédiatement après la dilution et le mélange.
Nous vous recommandons donc d’abord de mettre en place votre plaque expérimentale. Vous remarquerez le mélange répété des cellules tout au long de ce protocole, qui est extrêmement important dans les étapes jusqu’au placage. Le jour de l’expérience, tous les supports et autres solutions utilisés pour l’analyse doivent être filtrés à l’aide d’un filtre à deux microns, même s’ils sont déjà stériles, afin d’enlever les cristaux qui peuvent apparaître dans les images au microscope.
Cela inclut les médias expérimentaux et la solution Concanavalin A. Ensuite, préparez la plaque de microscope. Afin de garder la surface vitrée des puits à l’état des débris et des rayures, gardez toujours une peluche et un chiffon libre statique sous la plaque.
Utilisez une technique stérile sur un banc stérilisé. Filtrer 25 millilitres de 1X Concanavalin Une solution et pipette 200 microlitres dans chaque puits de la plaque de microscope. Nous recommandons de stabiliser la pipette pour assurer une hauteur appropriée.
Centrifugez la plaque de microscope avec une peluche et un lingette libre statique en dessous pendant deux minutes à 411 fois G afin d’enlever toutes les bulles d’air qui pourraient empêcher Concanavalin A d’enduire uniformément le fond des puits. Laissez reposer la plaque contenant la solution Concanavalin A pendant une à deux heures. Soyez cohérent dans vos expériences.
Après l’incubation de Concanavalin A, dégagez le Concanavalin A de la plaque de puits 96 soit avec un dispositif d’aspiration, soit en vidant de force la solution de la plaque comme on le voit ici. Quelques gouttelettes resteront. Ensuite, lavez les puits en ajoutant 400 microlitres d’eau stérile à chaque puits.
Ajouter l’eau immédiatement après avoir enlevé la solution Concanavalin A. Ne laissez pas l’assiette sécher. Il est important d’éviter de toucher le fond enduit de la plaque avec les pointes de pipette afin de ne pas déplacer ou enlever Concanavalin A de la surface vitrée des puits.
Retirez l’eau de la même manière que la solution Concanavalin A et ajoutez immédiatement 185 microlitres de supports expérimentaux à votre plaque de microscope. Ne laissez pas la plaque reposer au sec. La plaque est maintenant prête pour l’ajout de 50 microlitres de cellules diluées.
Récupérez votre assiette randomisée pré-cultivée de 96 puits. Votre question expérimentale déterminera si les cellules sont saturées ou en phase de journal et le nombre de répliques randomisées qui devraient être utilisées dans l’analyse. Centrifugez votre assiette pendant deux minutes à 411 fois G afin de minimiser les risques de contamination croisée lors de l’enlèvement du revêtement en papier d’aluminium.
Assurez-vous de ne jamais incliner votre assiette lorsque vous la manipulez. Si la levure et les supports entrent en contact avec le papier d’aluminium qui recouvre la plaque, il peut y avoir contamination entre les puits. Préparez d’abord les plaques dans qui vous effectuerez vos dilutions en série.
Ajoutez 90 microlitres de supports expérimentaux à chacune de vos plaques de dilution. Ensuite, préparez vos cellules. Soyez extrêmement prudent lorsque vous retirez le papier d’aluminium de votre plaque de 96 puits pour empêcher les gouttelettes d’un puits d’entrer dans un autre.
La levure sera concentrée au fond de la plaque en raison de la centrifugation. Pour s’assurer que les cellules sont bien mélangées pendant votre dilution, ajoutez toujours un petit volume de cellules à un plus grand volume de médias. Ajouter ensuite un autre grand volume de supports au mélange.
Assurez-vous de pipette mélanger vigoureusement à chaque étape. Dans cette vidé o, nous avons effectué des dilutions pour les cellules de levure à saturation et les supports synthétiques complets, que nous diluerons 10 000 fois pour atteindre une concentration finale d’environ 4000 cellules par puits dans la plaque de microscope. Pour suspendre à nouveau les cellules, pipette de haut en bas vigoureusement et déplacer la pointe pipette autour du puits dans un mouvement circulaire.
Après le mélange, il ne devrait pas y avoir de traces de levure séd installée restant dans tout bien comme on le voit ici dans bien A1. Tous les autres puits présentés ici n’ont pas été suspendus de nouveau pour comparaison. Comptez les cellules dans votre plaque pré-cultivée, par exemple, avec l’hémomètre, et combinez avec n’importe quelle autre souche que vous ajouterez au même puits dans des proportions égales. Ici, nous mélangeons les cellules de notre plaque pré-cultivée avec une souche de référence fluorescente à un rapport un à un.
Une fois que vos concentrations cellulaires sont normalisées, ajoutez dix microlitres de cellules à la première plaque de dilution en série. Ajoutez ensuite 100 microlitres de supports à un volume final de 200 microlitres. Avec l’ajout de cellules et de supports, pipette mélanger vigoureusement, déplaçant la pointe pipette autour des puits dans un mouvement circulaire.
À partir de ce moment, jusqu’à ce que les cellules soient ajoutées à la plaque de microscope, passez rapidement par le protocole. Ensuite, ajoutez dix microlitres de levure de la première plaque de dilution en série dans la deuxième plaque de dilution en série. Ajoutez ensuite 100 microlitres de médias expérimentaux à cela.
Bien mélanger. Si votre levure n’a pas tendance à flocculer, alors ils sont prêts à être ajoutés à la plaque de microscope directement après cette étape. Procéder immédiatement au placage.
Cependant, si les souches de levure que vous utilisez ont une tendance modérée à flocculer, l’étape optionnelle suivante de sonication sera nécessaire. Si la sonication, la première pipette mélanger la solution de levure une fois de plus, avant la sonication. Placez la levure diluée sur le sonicateur et submergez les broches de 96 puits dans la solution de chaque puits, mais ne touchez pas le fond du puits.
Définissez le programme de sonication, qui est suffisamment fort pour briser les cellules de levure flocculated, mais ne tue pas les cellules ou causer des réponses élevées de stress. Certains tests peuvent être nécessaires pour identifier le meilleur programme de sonication pour une expérience donnée. Une fois le programme terminé, retirez les cellules et passez immédiatement à l’étape suivante.
Ajouter 15 microlitres de levure de la deuxième plaque de dilution en série dans la plaque de microscope. Pipette de haut en bas pour mélanger, mais le faire soigneusement pour éviter de déranger le Concanavalin A attaché au fond des puits de la plaque. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de supports expérimentaux à un volume final de 400 microlitres, à la plaque de microscope.
Pipette mélanger prudemment. Couvrir la plaque d’une membrane respirante. Assurez-vous que les bords de la plaque sont bien scellés.
Centrifugeuse de la plaque de microscope avec une peluche et un tissu libre statique en dessous pendant deux minutes à 411 fois G afin que les cellules de levure à attacher à la Concanavalin A au fond de la plaque. La plaque est maintenant prête à être photographiée. Au microscope, essuyer le haut et le bas de la plaque à l’aide d’une peluche et d’un lingette libre statique et souffler l’air comprimé sur le fond de la plaque pour enlever les débris.
Placez la plaque sur le microscope. Assurez-vous que le puits A1 se trouve dans le coin supérieur gauche et que le microscope est chauffé à la bonne température pour la croissance cellulaire. Assurez-vous également que la plaque est soigneusement rentrée dans le microscope et que le fond de la plaque est plat.
Si la plaque a un couvercle en plastique, retirez-la avant de commencer la microscopie. Ce sera important pour capturer de bonnes images pour l’analyse en aval. Nous chargeons un fichier généré automatiquement avec les coordonnées X et Y et les positions focales pour l’image de l’ensemble de la plaque de microscope.
Si vous utilisez un fichier prégénédé, vérifiez quelques positions dans la plaque de microscope pour vous assurer que les cellules se trouvent dans le bon plan focal. Il est utile pour le plan focal d’être légèrement au-dessus des cellules de sorte qu’ils sont entourés par une jante foncée et ils sont plus lumineux que l’arrière-plan. Définissez le nombre de points de temps et l’espacement du point de temps que vous utiliserez pour l’expérience.
Si vous recueillez à la fois des données sur le taux de croissance et l’intensité de la fluorescence, mettez sur place un programme d’imagerie par fluorescence. Ajustez la luminosité de chaque canal pour qu’il soit photographié de sorte qu’aucune position sur la plaque de microscope ne soit surexposée. Testez l’exposition que vous utiliserez lorsque vous n’êtes pas en mode live.
Pour les images fluorescentes, la fluorescence doit être visible à l’œil nu. Mais sinon, nous recommandons de fixer de faibles valeurs d’exposition. Des colonies convenablement espacées ensemencées par des cellules individuelles se développent dans un monocouche le long de la surface de la plaque.
Par conséquent, l’analyse automatisée de l’image peut être utilisée pour calculer avec précision le taux de croissance de nombreux microcolonies individuelles. Les marqueurs fluorescents peuvent être utilisés pour différencier les souches multiples qui poussent dans le même puits. Par conséquent, des distributions entières des taux de croissance des microcolonies individuelles qui poussent dans un environnement partagé peuvent être calculées.
Les grandes tailles d’échantillons réalisables avec cette expérience permettent également une estimation précise des différences moyennes entre les différentes souches ou conditions de croissance. Ici, les taux de croissance des ensembles appariés de colonies cultivées dans des puits simples à partir d’un ensemble de lignes d’accumulation de mutations et les colonies de contrôle de référence GFP en puits sont indiqués. Si l’on observe des cellules s’agglutiner sur la plaque du microscope, les touffes doivent être brisées par sonication avant le placage.
Les cellules des touffes qui ne sont pas brisées ne se développeront pas dans une microcolonie planaire le long de la surface de la plaque, rendant impossible le calcul correct du taux de croissance. Tous les supports ne sont pas compatibles avec l’analyse du taux de croissance de la microcolonie. Certaines formes de médias, y compris les médias qui contiennent de l’extrait de levure ou a un faible pH, empêcher la liaison des cellules à Concanavalin A.This se traduit par des cellules flottant loin de la croissance des microcolonies au cours de l’expérience et une mesure erronée du taux de croissance.
Il est important d’éviter de placage des cellules trop densément. Lorsque les cellules sont plaquées trop étroitement, les microcolonies à croissance plus rapide fusionnent aux points de temps antérieurs, montré ici comme une perte de suivi des couleurs. Cet effet peut biaiser les estimations des taux de croissance, car les colonies à croissance lente sont moins susceptibles de fusionner avec leurs voisins avant que les données provenant de points de temps suffisants ne soient recueillies.
Selon les conditions de croissance, un sous-ensemble de cellules peut subir une phase de décalage avant de commencer à croître. Il est important d’en tenir compte lorsque l’on utilise les zones de colonies pour calculer le taux de croissance plutôt que d’adapter une courbe de croissance à tous les points de temps disponibles. Le protocole décrit peut être utilisé pour étudier un large éventail de questions liées à la croissance et à l’évolution de la levure.
Son format de microplaque flexible signifie qu’il peut être adapté à d’autres espèces de levures, à différentes conditions de croissance, à d’autres microbes et potentiellement à d’autres cellules en culture.
