Cette technique permet le développement d’un système standardisé facile à mettre en place à partir de lignées cellulaires humaines ou de populations cellulaires primaires et fournit les caractéristiques d’une structure bien organisée, semblable à la moelle osseuse. Ce modèle permet à la post-fixation de récolte cellulaire de caractériser la localisation cellulaire in situ dans le système via l’imagerie, ou la dissociation de structure 3D pour collecter chaque composant cellulaire pour des études moléculaires ou fonctionnelles. La démonstration de la procédure sera assurée par Kevin Geistlich, un ingénieur adjoint de mon laboratoire.
Peser de 35 à 40 milligrammes de billes de BCP dans un tube de 1,5 millilitre pour chaque insert. C’est-à-dire une petite antenne cylindrique en plastique avec une membrane en polycarbonate au fond. Percez un petit trou avec une aiguille propre à travers le haut du tube de 1,5 millilitre pour éviter que le couvercle ne s’ouvre pendant le cycle d’autoclave et placez les tubes en position verticale dans une boîte fermée et stérile.
Placez des inserts de culture cellulaire en polycarbonate stérile dans les puits d’une plaque de six puits. Versez des billes de BCP stériles provenant d’un tube de 1,5 millilitre dans l’insert. Lavez soigneusement les billes en versant 350 microlitres de 1X PBS à l’intérieur de l’insert, puis ajoutez 4,5 millilitres de 1X PBS au puits.
Jetez le PBS à l’aide d’un vide ou d’une pipette de cinq millilitres en plaçant la pointe dans un coin du puits. Répétez l’étape de lavage deux fois. Ensuite, utilisez 1X PBS complété par 10% FBS pour bloquer le système.
Ajoutez soigneusement 350 microlitres de solution de blocage à l’insert et 4,5 millilitres au puits, puis placez la plaque entière dans un incubateur pendant la nuit. Retirez la solution de blocage du système. Mélanger 1 fois 10 aux 6 cellules HMEC-1 et 2 fois 10 aux 6 cellules HS27A, représentant respectivement les compartiments des cellules stromales vasculaires et mésenchymateuses, dans un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse pendant cinq minutes à 1 575 G à température ambiante.
Jeter le surnageant et ajouter 175 microlitres de milieu HMEC-1, complétés par 175 microlitres d’ODM qui favoriseront la différenciation des cellules stromales mésenchymateuses en ostéoblastes. Versez 350 microlitres de la suspension cellulaire contenant 3 fois 10 à 6 cellules totales à l’intérieur de chaque insert. Ensuite, versez 4,5 millilitres du média combiné sans cellules dans les puits de la plaque.
Aspirer doucement et distribuer le mélange plusieurs fois avec une micropipette d’un millilitre pour homogénéiser les cellules et les billes de PCA dans l’insert. Laisser le mélange entier se déposer au bas de l’insert. Une fois que les cellules endothéliales et mésenchymateuses sont homogénéisées à l’intérieur de l’insert, conservez la plaque à six puits à l’intérieur de l’incubateur pendant trois semaines.
Changez le milieu à l’intérieur de l’insert dans le puits deux fois par semaine en retirant soigneusement le milieu à l’aide d’une micropipette d’un millilitre et en plaçant l’embout sur la paroi intérieure de l’insert pour éviter de déranger le coin de l’insert. Resuspendre les cellules hématologiques d’intérêt dans le milieu combiné HMEC-1 et RPMI et ajouter la suspension cellulaire à l’insert. D’autres types de cellules d’intérêt avec des médias dédiés peuvent être ajoutés à cette étape.
Si un protocole de traitement médicamenteux est nécessaire, attendez 24 heures après l’ajout des cellules d’intérêt avant de les traiter, ce qui leur donne le temps d’adhérer à la structure osseuse. Actualisez le milieu avec 50 % de milieu complet HMEC-1 et 50 % de milieu complet RPMI deux fois par semaine. Après avoir changé le milieu de culture deux fois par semaine, conservez le surnageant récupéré de l’intérieur de l’insert à moins 80 degrés Celsius pour évaluer la production de protéines dans le système.
Pour dissocier les cellules de la structure 3D, mélangez 4,5 millilitres de RPMI avec 0,5 millilitre de FBS, complété par 0,4 milligramme par millilitre de collagénase dans un tube de 15 millilitres. Ensuite, réchauffez la solution à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Placez l’insert à l’envers sur un couvercle de plaque stérile à six puits pour découper correctement la membrane.
Utilisez un scalpel stérile pour couper la membrane des côtés, récupérant ainsi un disque solide blanc. Placez le disque à l’intérieur du tube chaud de 15 millilitres contenant le mélange de solution préparé précédemment. Placez le tube dans une roue active dans un incubateur à 37 degrés Celsius et incuber pendant 10 minutes pour permettre la digestion.
Appliquez le même temps d’incubation pour toutes les membranes afin d’éviter une analyse biaisée. Après l’incubation, centrifuger le tube de 15 millilitres pendant cinq minutes à 1 575 g à température ambiante. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans cinq millilitres de PBS chaud 1X.
Remettez la pastille en suspension dans 300 microlitres de trypsine chaude et mélangez bien en pipetant pendant 10 secondes, puis placez-la dans un bain-marie réglé à 37 degrés Celsius pendant une minute. Arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant un millilitre de FBS chaud et pur. Avec une micropipette d’un millilitre, aspirer mécaniquement et distribuer le milieu pour dissocier complètement le disque.
Centrifuger le tube pendant cinq minutes à 1 575 G et remettre en suspension la pastille dans trois millilitres de 1X PBS complété par 10% FBS. Laissez les billes sédimenter pendant cinq secondes avant de recueillir le surnageant et de le filtrer à travers une crépine cellulaire de 35 microns placée sur un tube de collecte. Centrifuger le filtrat récupéré pendant cinq minutes à 1 575 G et compter les cellules avec du bleu de trypan pour évaluer la viabilité.
Remettez les pastilles en suspension dans le mélange d’anticorps et incuber pendant 30 à 40 minutes sur de la glace à l’abri de la lumière. Ajouter un millilitre de PBS complété par 2%FBS pour laver les cellules et centrifuger pendant cinq minutes à 1 575 G.To lancer l’analyse de cytométrie en flux, remettre en suspension la pastille récupérée dans 200 microlitres de PBS 1X avec 10%FBS, complété par DAPI dans une solution de 1 à 2000. Analyser les tubes dans un cytomètre en utilisant les paramètres décrits dans le manuscrit texte.
Utilisez un graphique FSC-H versus FSC-W pour inclure la population singulet. Dans la fraction singulet, utilisez un graphique DAPI-A par rapport au FSC-A pour déterminer la population cellulaire viable. Avec la population DAPI négative précédemment contrôlée, utilisez un graphique APCA-A par rapport à FSC-A pour déterminer la population CD45-positive.
Pour fixer la structure de type BM, transférez l’insert de l’ancienne plaque vers une nouvelle plaque à six puits remplie de 1X PBS. Ensuite, remplacez délicatement le support à l’intérieur de l’insert par 1X PBS. Une fois l’insert lavé, placez-le dans une nouvelle assiette à six puits et remplissez le puits et l’insert avec du paraformaldéhyde fraîchement ouvert.
Laissez le processus de fixation se dérouler pendant quatre heures à température ambiante, à l’abri de la lumière. Ensuite, lavez l’insert une fois avec 1X PBS et rangez-le à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. Après l’exposition souhaitée, les résultats suggèrent qu’il était possible de maintenir les cellules hématologiques pendant au moins six semaines dans le modèle 3D avant de récupérer des cellules viables.
Il a été possible de remplacer la lignée cellulaire HS27A par une CSM primaire normale de la moelle osseuse ou une CSM de leucémie myéloïde aiguë dans ce modèle 3D de type BM, ou de remplacer la lignée cellulaire hématopoïétique par des CSH primaires. L’incorporation de paraffine et l’immunochimie ont permis avec succès l’analyse des contenus CD45 et CD73 à l’aide des modèles 3D. Ce système 3D nécessite trois semaines de structures ressemblant à de la moelle osseuse et du temps supplémentaire avec les cellules d’intérêt.
Et les conditions stériles doivent être maintenues car parfois, nous pouvons voir des contaminations moyennes avec les changements de milieu bihebdomadaires.
