Le financement fourni par la National Science Foundation (MF).

Présentation L&#39;OMT est une adaptation d&#39;un système d&#39;ancrage magnétiques [1] visant à intégrer un &quot;simulateur de panache virtuel&quot;. Les protocoles suivants expliquent comment vole ancrage correctement (partie 1) et fournir des stratégies pour la mise en place des aimants (Partie 2) et de débit massique système réglementé de livraison odeur (Part3). Les informations décrites ici sont optimisés pour ce système particulier et peut varier pour les composants avec d&#39;autres spécifications techniques. Partie 1: mouches Tethering Les étapes pour attacher décrites ici sont similaires à de nombreuses études antérieures [2], mais adapté pour une utilisation dans un OMT [3]. Tethering appropriée est cruciale pour assurer robuste et reproductible des essais expérimentaux. L&#39;importance de la fonction modem attention ne peut pas être surestimée. <ol><li> Recueillir des mouches 4-6 jours après l&#39;éclosion et les affamer pendant 4-6 heures. Placer un Kimwipe humidifié avec de l&#39;eau dans le flacon foodless pour éviter la dessiccation. </li><li> Transfert d&#39;un lot de mouches dans une bouteille d&#39;un petit flacon et l&#39;insérer dans un bloc de laiton sur une étape de refroidissement Peltier fixé à environ 4 degrés Celsius. La bonne température anesthésie les mouches dans les 30 secondes environ. </li><li> Trier les mouches sur la surface froide de l&#39;étape de refroidissement. Un Kimwipe humides assure un refroidissement constant et évacue l&#39;humidité de la cuticule. Sélectionnez le plus important pour attacher les femelles. </li><li> Utiliser une brosse fine, pousser une seule mouche dans une position dans le sarcophage en forme sur mesure pour accueillir une seule volée de fruits sauvages de type femelle. <img src="/files/ftp_upload/old/1063_2008_11_26_2/1063_Figure-01_thumb.png" alt="" /> Figure 1. <a href="https://www.jove.com/files/1063_2008_10_28_1/1063_Figure-01.png">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de la figure de l&#39;.</a> </li><li> Nous positionnons une épingle minutien (Amendes Science Tools) avec un barreau magnétique montée sur un micromanipulateur. La broche est d&#39;être alignés de telle sorte que l&#39;extrémité émoussée touche le thorax dorsal juste derrière la tête entre les deux ailes. La broche doit être parfaitement vertical vus de front vers les yeux. Même une petite quantité de &#39;roll »entre la volée et la broche ne peut pas être toléré. L&#39;angle de vision latérale entre la broche et l&#39;axe longitudinal du corps doit être à un angle de cabré de 30 degrés par rapport à l&#39;horizon (fig. 1). Remarque: Pour un fonctionnement optimal dans l&#39;attache aimant, les broches peuvent avoir besoin d&#39;être taillés pour des longueurs plus courtes. Cela dépendra entièrement de la distance entre les aimants de suspension. </li><li> Une fois la goupille minutien est aligné, utiliser un fil d&#39;acier minces d&#39;appliquer une petite goutte de colle UV-activé (Electrolite Corp) à l&#39;extrémité émoussée de l&#39;épingle minutien. </li><li> Manipuler la broche afin de la gouttelette de colle touche le thorax de la mouche juste au-dessus de la tête. Avec la bonne taille de goutte, la colle doit recuit et le débit de l&#39;épingle sur le thorax. Soyez prudent de ne pas utiliser trop de colle. </li><li> Cure de la colle avec deux rafales 20 secondes de la lumière UV. </li><li> Placez la volée fixe de côté et répétez. Trancher des petits carrés de Kimwipe et avec une pince en donner un à chaque mouche attachée à restreindre vol. </li><li> Après une heure de récupération, les mouches attachés sont prêts pour des expériences. </li><li> Collage incorrecte peut nuire à la capacité d&#39;une mouche à effectuer dans l&#39;arène aimant. Chaque volée doit être vérifié pour une rotation en douceur au début de chaque expérience pour assurer les mouches sont correctement collé. Ceci peut être accompli par rotation d&#39;un motif à rayures avec une période suffisamment importante pour susciter des réponses spatiales optomoteur forte [4]. Si la mouche est collé à l&#39;angle de tangage mal ou inclinée sur la broche par rapport à l&#39;axe de roulis, la mouche (i) ne peut pas tourner du tout, (ii) ont une gamme limitée de mouvement, ou (iii) tournent à incompatibles vélocité. Dans le cas ci-dessus à la volée doit être jeté et remplacé par un nouveau. Si cela résout le problème le plus probable était un cas de collage inapproprié. (Si le remplacement à la volée ne résout pas le problème, voir Partie 2.4) </li></ol> Partie 2: Alignement des aimants Alignement des aimants (terres rares-magnets.com) est correctement nécessaires à la volée pour obtenir une gamme degré lisses 360 de mouvement. Suivez ces étapes pour aligner correctement les aimants. <ol><li> Les aimants anneau inférieur sont tenues horizontalement par un manchon en plastique et placé directement sur le dessus d&#39;une chambre à vide clair (Fig. 1; décrit plus loin dans la partie 3). L&#39;aimant tige supérieure est fixée à la verticale d&#39;environ 3 / 4 &quot;au-dessus des aimants inférieurs. </li><li> Environ aligner les aimants supérieur et inférieur visuellement en plaçant l&#39;aimant tige supérieure directement au-dessus du point central de l&#39;anneau inférieur aimants. Il est utile de joindre l&#39;aimant supérieur à un micromanipulateur (Siskiyou Inc) pour un réglage à échelle fine. </li><li> Époxy un roulement V-bijou (petites pièces) sur la surface inférieure de l&#39;aimant supérieur pour minimiser la friction de rotation et de positionnement de normaliser la mouche. </li><li> Placez une mouche dans l&#39;arène et d&#39;ajuster l&#39;horizontale et vla position VERTICALE de l&#39;aimant supérieur jusqu&#39;à la mouche peut en douceur et progressivement tourner sur 360 degrés dans l&#39;axe de lacet. Chaque volée doit être vérifié pour une rotation en douceur au début de chaque expérience pour assurer les aimants sont correctement alignés et que les broches individuelles minutien ne sont pas endommagés (voir partie 1.11). Si les aimants ne sont pas correctement alignés à la volée (i) ne peut pas tourner du tout (ii) ont une gamme restreinte de mouvement (iii) tournent à des vitesses incompatibles. Si le problème est résolu en remplaçant la volée avec un nouveau, il était probablement dû à un problème de collage (voir partie 1). Si ces problèmes existent pour chaque vol, il est probablement un problème avec l&#39;alignement des aimants et d&#39;autres ajustements seront nécessaires. </li><li> Attention: tout en jouant avec des aimants de terre rare peut être amusant, ils sont très dangereux. Mauvais usage des résultats dans les équipements endommagés et / ou des lésions corporelles mineures. Soyez extrêmement prudent avec ces aimants tentante pourtant facilement sous-estimée. </li></ol> Partie 3: Odeur de livraison <ol><li> Le système de livraison est basé sur l&#39;odeur celui décrit précédemment [5] et est la partie la plus difficile à optimiser (Fig. 1). Il exige beaucoup de patience et d&#39;essai-erreur. Suivez ces étapes pour réaliser le suivi des odeurs stable. </li><li> La mise en place initiale du système d&#39;odeur nécessite courir voie étroite Téflon tube (petites pièces) à partir du gaz (Sable Systems International) multiplexeur intégré à la coutume de l&#39;eau / odeur flacons. La sortie de ces flacons se connecte directement au port de tubes hypodermiques en utilisant la même tubulure en téflon. </li><li> Une chambre à vide en acrylique transparent est placé sous l&#39;arène pour soutenir les aimants. Nous utilisons un tube de verre de 4mm monté sous la volée relié à la chambre à vide pour amener le plus près de l&#39;ouverture à vide à la volée et de réduire le diamètre de l&#39;ouverture. </li><li> Placez une mouche captif dans l&#39;arène en utilisant une pince. </li><li> Mettez une odeur attrayante (vinaigre de cidre de pomme fonctionne bien), et vérifier visuellement que la mouche des pistes de l&#39;odeur. Si la mouche ne semble avoir aucune préférence pour l&#39;odeur, suivez les trois prochaines étapes. Cela peut nécessiter plusieurs mouches, et plusieurs essais. </li><li> Ajustez la position du port d&#39;odeur jusqu&#39;à ce que la mouche paraît pour suivre l&#39;odeur. Nous avons monté les ports odeur sur micromanipulateurs (Siskiyou Inc) et positionné 4mm et 3mm dorsale antérieure à la tête de la mouche. </li><li> Régler le débit de masse jusqu&#39;à ce que la mouche paraît pour suivre l&#39;odeur. Nos réglages sont 7ml/min (Sable Systems International MFC-4). </li><li> Régler le débit de l&#39;aspirateur jusqu&#39;à ce que la mouche paraît pour suivre l&#39;odeur. Nous avons fixé le débit vide à 13l/min utilisant un régulateur de débit (Cole Parmer). Note: les lignes d&#39;alimentation du bâtiment sous vide peut fluctuer au fil du temps causant des fluctuations dans la structure du panache. Il peut être utile pour connecter une pompe à vide externe au régulateur de débit pour des conditions de débit constant sous vide. </li><li> Une fois la position du port et les débits sont fixés périodiquement basculer entre la vapeur d&#39;eau et de vapeur d&#39;odeur livrer l&#39;aide d&#39;une commutable en utilisant un multiplexeur de gaz et de vérifier visuellement que la mouche que les pistes de l&#39;odeur quand l&#39;odeur est allumé. Parfois, l&#39;odeur résiduelle à l&#39;intérieur du port d&#39;odeurs peuvent provoquer des odeurs de suivi lorsque l&#39;odeur est éteint. Ceci peut être éliminé sans enlever l&#39;odeur du port correctement positionné en remplissant des tubes hypodermiques avec de l&#39;éthanol et la collecte sur le bout de livraison avec un Kimwipe. Utiliser l&#39;air comprimé, souffler toute l&#39;éthanol restant hors et de reprendre les expériences. </li></ol> Les résultats représentatifs: Lorsque ces étapes sont suivies correctement deux choses doivent être observées. D&#39;abord, sous constante rotation des stimuli visuels attachés à une mouche placée dans l&#39;OMT devrait tourner sans problème sur 360 degrés dans l&#39;axe de lacet. &quot;Jerky&quot; tours (appelés saccades) sont caractéristiques de comportement en virage spontanée en l&#39;absence de la constante de stimuli visuels. Si les mouches peuvent apparemment pas tourner en douceur, le collage incorrecte (voir partie 1) et les aimants peuvent être alignées à blâmer (voir partie 2). Deuxièmement, lorsque l&#39;odeur est allumé, la mouche devrait prendre la direction de l&#39;odeur. Lorsque l&#39;odeur est éteint, la mouche devrait saccade spontanément avec de préférence pour aucun position unique dans l&#39;arène. Si les mouches ne participent pas activement suivre le panache d&#39;odeur, la position du port de l&#39;odeur, le débit d&#39;air et / ou le débit de vide peut nécessiter un ajustement (voir partie 3).

<ol>
	<li>Bender, J. A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+stimulation+of+saccades+in+magnetically+tethered+Drosophila.">Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).</li><li>Tammero, L. F., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collision-avoidance+and+landing+responses+are+mediated+by+separate+pathways+in+the+fruit+fly,+Drosophila+melanogaster.">Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).</li><li>Duistermars, B. J., Frye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossmodal+visual+input+for+odor+tracking+during+fly+flight.">Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight.</a> Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).</li><li>Reiser, M. B., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+display+system+for+insect+behavioral+neuroscience.">A modular display system for insect behavioral neuroscience.</a> J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).</li><li>Frye, M. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+output+reflects+the+linear+superposition+of+visual+and+olfactory+inputs+in+Drosophila.">Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).</li></ol>

Attacher les mouches et les odeurs de suivi susciter stable dans ce domaine est relativement simple. Elle exige la pratique, de patience et de tâtonnements. De nombreuses parties de cette arène pourrait encore être optimisé ou substitué à céder variations de potentiel expérimental. Par exemple, les nouvelles versions de la chambre à vide sont beaucoup plus petits et de permettre plus d&#39;espace ci-dessous l&#39;arène. En outre, la force et le type d&#39;aimants de terre rare peut être légèrement varié et les ports d&#39;odeu...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cooling Stage</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Teca</td>
<td>LHP-300CP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Brass Cooling Block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Machined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>~4 x 8 x 2cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Sarcophagus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom Machined</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contact us for details</td>
</tr>
<tr>
<td>UV-Activated Glue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kemxert corp</td>
<td>KOA300</td>
<td>1oz bottle lasts years</td>
</tr>
<tr>
<td>Panel System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caltech</td>
<td>http://www.dickinson.caltech.edu/panels</td>
<td>[4]</td>
</tr>
<tr>
<td>Minutien Pins</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>26002-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lower Ring Magnets</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rare-earth-magnets.com</td>
<td>NSN0615</td>
<td>5 - 0.75"o.d. x 0.375" i.d. x 0.125"</td>
</tr>
<tr>
<td>Upper Rod Magnet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Rare-earth-magnets.com</td>
<td>NSN0750</td>
<td>0.125" x 1"</td>
</tr>
<tr>
<td>V-Jewel Bearing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>VJ-0469-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MFC-4 Flow Regulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Systems International</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas Multiplexer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sable Systems International</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Teflon Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>STT-20-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>20 Gauge Hypodermic Tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Small Parts</td>
<td>HTX-20R-06</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4mm o.d.</td>
</tr>
<tr>
<td>Vacuum Flow Regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cole Parmer</td>
<td>EW-32464-52</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a magnetic tether system to investigate visual and olfactory mediated flight control in drosophila

Il est clair depuis de nombreuses années que les insectes utilisent des repères visuels pour stabiliser leur tête dans un flux de vent. Beaucoup d&#39;animaux piste des odeurs transportées par le vent. En tant que tel, la stabilisation visuelle de vent suivi directement dans le suivi des aides d&#39;odeur. Mais ne signaux olfactifs influencer directement le comportement de suivi visuel indépendamment de signaux vent? En outre, le récent déluge de la recherche sur la neurophysiologie et la génétique du comportement neurologique de l&#39;olfaction chez la drosophile a motivé de plus en plus techniquement sophistiqués et quantitatif des dosages de comportement. Ici, nous avons modifié un système d&#39;ancrage magnétiques initialement conçu pour des expériences de la vision en équipant l&#39;arène avec panache laminaire étroites odeur de flux. Une mouche est collé à une petite tige en acier et en suspension dans un champ magnétique qui lui permet de lacet librement. Petite panaches de diamètre alimentaires odeurs sont dirigés vers le bas sur la tête à la volée s, suscitant suivi stables par une mouche faim. Nous nous concentrons ici sur les mécanismes essentiels du tethering, en alignant les aimants, concevoir le panache d&#39;odeur, l&#39;odeur et la confirmation de suivi stable.

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A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

Nous décrivons ici comment attache une mouche dans un appareil olfactif magnétique attache (OMT). Nous décrivons comment aligner les aimants des terres rares et des ports d&#39;odeur, et la façon de fixer les taux de débit massique pour les deux la livraison de relance et d&#39;aspiration à réaliser le suivi des odeurs optimale.

Un système d&#39;attache magnétique d&#39;enquêter sur les visuels et olfactifs Flight Control Mediated chez la drosophile

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.2K vues.  University of California, Los Angeles. Nous décrivons ici comment attache une mouche dans un appareil olfactif magnétique attache (OMT). Nous décrivons comment aligner les aimants des terres rares et des ports d'odeur, et la façon de fixer les taux de débit massique pour les deux la livraison de relance et d'aspiration à réaliser le suivi des odeurs optimale.

Vidéo: A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Visuellement Suivi Odeur Mediated Pendant le vol chez la drosophile

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Recherche

Biologie

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Enregistrements aspiration simple cellule à partir de cônes photorécepteurs de la souris

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

Une approche pratique de la cartographie inductible destin génétique: un guide visuel à Mark et Track Cellules In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Homogène de détection rapide des essais biologiques utilisant un support magnétique Système de modulation Biosensing

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

Chromatographie d&#39;affinité lipidique des vésicules médiée utilisant magnétique tri cellulaire activé (LIMACS): une nouvelle méthode pour analyser les interactions protéines-lipides

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Dépistage ARNi pour identifier les phénotypes postembryonnaires dans C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Mesure quantitative de invadopodes la protéolyse matrice extracellulaire dans des contextes simples et multicellulaire

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Conception et analyse du comportement de préférence de température et de son rythme circadien chez la drosophile

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Une méthode améliorée pour la mesure précise et rapide des performances de vol en<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validation d&#39;un modèle de souris de perturber CLIC complexes de façon spécifique à la cellule

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...