Nous reconnaissons l&#39;appui de subventions des NIH R01 DE021683, DE019434 R01, U01 HL099776, la Fondation Oak et le laboratoire Hagey for Pediatric médecine régénérative.

REMARQUE: déclaration éthique: Toute recherche impliquant des animaux vertébrés a été réalisée dans les protocoles de conformité approuvés par la commission administrative de Stanford sur le soin des animaux de laboratoire (APLAC). 1. Préparation <ol><li> Autoriser 10 ml de milieux disponibles dans le commerce de séparation cellulaire à gradient de densité (qui contient le polysucrose et de diatrizoate de sodium, ajusté à une densité de 1,077 g / ml) de venir à la température ambiante dans un tube conique de 50 ml. </li><li> Préparer cytométrie en flux (FACS) avec un tampon phosphate de 1x solution saline tamponnée (PBS) et 2% de sérum de veau foetal (SVF). Il suffit de 50 ml aliquote et maintenir cette aliquote à la température ambiante pour une utilisation au cours de l&#39;étape de milieux de séparation cellulaire à gradient de densité. </li><li> Avoir un seau de glace prêt à maintenir le tissu isolé et cellules en cours de la procédure d&#39;isolement. </li></ol> 2. Préparer les milieux de culture <ol><li> Préparez le support de base: MEM (Minimal Essential Medium), sans rouge de phénol (500 ml), le glutamate (1x), FCS (10x), 10 000 unités / ml penicillin (1x). </li><li> Filtre milieux de base avec un filtre de 0,22 um. </li><li> Préparer os médias moelle macrophages par induction: <ol><li> 50 ml de milieux de base préparé à l&#39;étape 2.1. </li><li> Ajouter la prostaglandine E2 (PGE2, M. 352,465 g / mol) à 10 -7 M concentration finale. </li><li> Ajouter Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF) à 10 ng / ml. </li><li> Ne pas filtrer la solution finale de macrophages de la moelle osseuse en stimulant médias. </li></ol></li><li> Préparez le support d&#39;induction des ostéoclastes: <ol><li> 50 ml de milieux de base préparé à l&#39;étape 2.1. </li><li> Ajouter la prostaglandine E2 (PGE2, M. 352,465 g / mol) à 10 -7 M concentration finale </li><li> Ajouter Macrophage Colony-Stimulating Factor (M-CSF) à 10 ng / ml. </li><li> Ajouter RANKL à 10 ng / ml. </li><li> Ne pas filtrer la solution finale de médias ostéoclastes d&#39;induction. </li></ol></li></ol> 3. Isolement de moelle osseuse <ol><li> Euthanasier une souris C57BL / 6Procédé utilisant le dioxyde de carbone par inhalation, suivie d&#39;une dislocation cervicale. NOTE: Les rongeurs doivent être euthanasiés par un personnel qualifié en utilisant la technique, matériel et les agents appropriés. </li><li> Positionner et fixer la souris sur une planche de dissection et pulvériser avec 70% d&#39;alcool. </li><li> Disséquer les fémurs, tibias, humérus et la colonne vertébrale. <ol><li> Commencez avec la souris en position couchée. Faire une incision verticale le long de la branche inférieure et commencer par dissection sur la longueur du fémur et du tibia en divisant les pièces jointes des tissus mous. Enfin, disloquer les os de l&#39;articulation du genou et de la hanche afin de libérer pleinement os du squelette. </li><li> Procéder pour faire une incision le long de la longueur du membre supérieur pour isoler l&#39;humérus. Disloquer l&#39;humérus à l&#39;épaule et du coude en disséquant doux attachement capsulaire de tissu. </li><li> Enfin, mettez la souris sur, de sorte que la souris est sujette. Faire une incision de la peau le long de la longueur de la colonne vertébrale, à la ligne médiane. Observez la douce paravertebralle tissu de chaque côté de la colonne vertébrale et incise le long du bord osseux de la colonne vertébrale, de dissection à travers la masse paravertébrale des tissus mous. En utilisant une paire de ciseaux, faire une coupe horizontale à travers la colonne vertébrale à la base du cou, et à la fin de la colonne vertébrale, juste en amont de l&#39;insertion de la queue, ce qui libère la colonne vertébrale de la fixation des tissus mous. </li></ol></li><li> Une fois que les os sont récoltées, les garder dans un tampon FACS sur la glace. </li><li> Utilisez du papier de soie pour nettoyer les muscles et les tissus mous de l&#39;os. </li><li> Placez les os nettoyés dans un mortier avec 3 ml de tampon FACS. </li><li> Concasser les os doucement dans le pilon et le mortier. </li><li> Aspirer le fluide et le transfert taché de sang dans un tube conique de 50 ml en faisant passer la solution à travers un tamis cellulaire de 70 pm. </li><li> Ajouter 5 ml de tampon FACS à l&#39;os écrasés et écraser davantage. Encore une fois, retirez le fluide à l&#39;aide d&#39;une pipette et transférer à la 50 ml tube conique à travers une passoire 70 um. </li><li> Typiquement écraser les os twiCE à trois fois dans du tampon FACS frais, à l&#39;aide d&#39;un mortier et d&#39;un pilon, ajoutant à chaque fois à nouveau 5 ml de tampon FACS frais, jusqu&#39;à ce que le liquide ne tache pas rouge. </li><li> Centrifuger la solution de la moelle osseuse à 200 xg pendant 5 min à 4 ° C pour obtenir un culot cellulaire. </li></ol> 4. Séparation Gradient de cellules de moelle osseuse <ol><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 10 ml de tampon FACS (maintenu à la température ambiante). </li><li> Prendre le tube conique de 50 ml contenant 10 ml de milieux disponibles dans le commerce de séparation cellulaire à gradient de densité (RT). </li><li> La solution de couche de moelle osseuse sur le gradient de densité des milieux de séparation cellulaire. Pour ce faire, lentement en utilisant une pipette électrique. Angle de la pointe de la pipette contre la surface intérieure vers le haut du tube conique et incliner le tube conique à environ 30 °. L&#39;utilisation d&#39;un réglage de la vitesse lente de la pipette, expulser doucement la solution de la moelle osseuse de manière à ne pas perturber le gradient de densité des milieux de séparation cellulaire. NOTE: En fin de compte il y auraune définition claire entre les deux solutions (solution cellulaire et la solution de milieu de séparation cellulaire en gradient de densité). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;une centrifugeuse à température ambiante, centrifuger le gradient de densité milieux de séparation cellulaire et de la solution de cellules dans une centrifugeuse équilibré à 200 xg pendant 15 min. En outre, supprimer l&#39;accélération et la décélération de la centrifugeuse afin d&#39;assurer une séparation de phases appropriée à l&#39;aide du gradient de densité de gradient de milieu de séparation cellulaire. </li><li> Après centrifugation, aspirer hors de la couche du milieu trouble qui contient les cellules de moelle osseuse d&#39;intérêt. </li><li> Transférer ces cellules dans un nouveau tube conique. Ajouter 20 ml de tampon FACS supplémentaire (conservé dans la glace) pour laver les cellules. </li><li> Centrifuger à 200 g pendant 5 min à 4 ° C pour obtenir un culot cellulaire. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml finale de stimulation des macrophages médias pour permettre le comptage des cellules en utilisant un hématimètre. </li></ol> 5. Décompte Cellulaire <ol><li> Prenez 10 pl de la solution cellulaire et mélangeravec 10 pi de bleu trypan. Charge 10 ul du mélange résultant SUR UNE hémocytomètre et obtenir le nombre de cellules par ml de solution. </li></ol> 6. La culture cellulaire <ol><li> Placer 2 ml de milieu de macrophage dans chaque puits d&#39;une plaque de 24 puits. </li><li> Ajouter 200.000 cellules dans chaque puits. NOTE: Dans notre expérience, la densité cellulaire placage est l&#39;un des besoins les plus cruciaux pour adéquat à la culture in vitro des ostéoclastes. </li><li> Agiter doucement la plaque et placer dans un incubateur régulière à 37 ° C. </li><li> Ne modifiez pas les médias pendant 3 jours. </li><li> Après 3 jours dans les médias de macrophage, changer les médias aux médias des ostéoclastes. </li><li> Ci-après, changer le quotidien des médias pendant 5-7 jours, à quel point, les grandes, les ostéoclastes multinucléées doit être visible sur la plaque de culture. </li></ol> 7. coloration avec résistant au tartrate acide phosphatase (TRAP) <ol><li> Après 5-7 jours in vitro de culture, aspirer les médias de la culture bien. </li><li> Laver les puits doucement avec du PBS 1X trois fois. </li><li> Fixer les cellules par addition d&#39;une solution de paraformaldéhyde à 4% et laisser reposer pendant 1 heure à 4 ° C. </li><li> Pendant ce temps, préparer la tache de TRAP (qui est disponible dans le commerce) par préchauffage à 37 ° C. </li><li> Après 1 heure dans du paraformaldéhyde, Aspirer paraformaldéhyde et laver délicatement 3 fois avec PBS 1x. </li><li> Ajouter 1 ml de colorant préchauffé piège dans chaque puits de la plaque à colorer. </li><li> Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 heure, à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Après 1 heure, aspirer la tache de TRAP. </li><li> Laver les puits 3 fois avec de l&#39;eau déminéralisée préchauffé. </li><li> Contre le bien à l&#39;hématoxyline de Gill (MISE EN GARDE) pendant 1-2 min. </li><li> ostéoclastes de l&#39;image en utilisant la microscopie à champ clair. </li><li> Laver les puits avec de l&#39;eau déminéralisée jusqu&#39;à une intensité de la couleur adéquate de la tache est réalisée, généralement lorsque les noyaux apparaissent blue. </li></ol> 8. résorption ostéoclastique Assay <ol><li> Utilisation d&#39;une boîte de culture de 24 puits en polystyrène disponibles dans le commerce qui est pré-revêtu d&#39;une ou l&#39;autre substrat de l&#39;os ou un revêtement de phosphate de calcium cristallin inorganique. </li><li> Placer 2 ml de milieu de macrophage dans chaque puits. </li><li> Ajouter 200 000 cellules de moelle osseuse fraîchement isolées obtenues à l&#39;issue de l&#39;étape 2 à chaque puits. </li><li> Agiter doucement la plaque avant de la placer dans un incubateur à 37 ° C pendant 3 jours. </li><li> Au jour 3, modifier le support de médias de la différenciation des ostéoclastes. </li><li> Effectuer des changements quotidiens des médias avec les médias de la différenciation des ostéoclastes pendant 5-7 jours. </li></ol> 9. Quantification de la résorption ostéoclastique activité <ol><li> Après 5-7 jours de culture dans un milieu de différenciation des ostéoclastes in vitro sur un substrat minéralisé, d&#39;analyser la surface minéralisée, comme décrit ci-dessous, afin d&#39;évaluer la capacité des ostéoclastes pour former resorptisur puits, un indicateur de l&#39;activité des ostéoclastes. </li><li> Aspirer le milieu de la plaque d&#39;essai de résorption et ajouter 100 ul d&#39;une solution d&#39;eau de Javel à 10% dans chaque puits. </li><li> Incuber les cellules avec la solution d&#39;eau de Javel à 10% pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Laver les puits 3 fois avec de l&#39;eau distillée. </li><li> Aspirer l&#39;eau restante et secouer l&#39;excès d&#39;eau de la plaque et laisser sécher à l&#39;air pendant 3-5 heures. </li><li> Contre la plaque avec un kit de coloration de Von Kossa disponible dans le commerce pour permettre la visualisation facile du substrat non résorbé. </li><li> Utilisez la microscopie à champ clair de prendre des images de pièces représentatives de la surface résorbée. </li><li> En utilisant le logiciel d&#39;analyse d&#39;image, calculer le pourcentage de la surface résorbé pour permettre une quantification de l&#39;activité de résorption ostéoclastique. </li></ol>

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Aucun des auteurs n&#39;a divulgation ou de conflit d&#39;intérêt à déclarer.

Une capacité d&#39;isoler et de cultiver facilement un grand nombre d&#39;ostéoclastes in vitro a été chargé d&#39;aider à faire progresser la compréhension de la biologie des maladies des os et des ostéoclastes. Il a été l&#39;identification de RANKL qui mènent à cela, quand il a récemment été identifié comme le principal régulateur de la formation des ostéoclastes, la différenciation et la survie 16-18. Il a été notre expérience que la culture ...

Le remodelage osseux est dynamique et implique le couplage de la formation osseuse à la résorption osseuse 1. Ce processus finement régulé est responsable du maintien du squelette au cours de l&#39;homéostasie normale, et en réponse à une blessure et maladie. Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées uniques qui sont capables de se résorber à la fois les matrices organiques et inorganiques de l&#39;os. Les ostéoclastes sont issus de la lignée des monocytes / macrophages de la moelle osseuse 5.2. Les anomalies de la fonction ou de la formation des ostéoclastes peuvent entraîner une variété de pathologies cliniques, y compris les conditions courantes telles que l&#39;ostéoporose. La capacité de générer des ostéoclastes in vitro a permis des avancées significatives dans notre compréhension de la biologie de l&#39;os 6. En conséquence, de nouveaux agents thérapeutiques émergent pour traiter des maladies liées aux ostéoclastes qui sont responsables de la morbidité et de la mortalité importantes 7 </sjusqu&#39;à&gt;. Entretien homéostatique de la masse osseuse et la force nécessite l&#39;action concertée des ostéoblastes de la formation osseuse et les ostéoclastes de résorption osseuse 8,9. homéostasie osseuse est modifiée dans un certain nombre de maladies, y compris l&#39;ostéoporose post-ménopausique, dans lequel une activité accrue des ostéoclastes conduit à la perte pathogène de la masse osseuse et de la densité 10. Avec l&#39;augmentation de la disponibilité des modèles murins transgéniques de la maladie humaine, il n&#39;y a plus possibilité de déchiffrer le rôle des ostéoclastes dans la maladie de l&#39;os humain 11-13. De nombreux protocoles pour des techniques de culture d&#39;ostéoclastes apparaissent dans la littérature, avec de nombreuses variantes décrites 9,12,14. Xing et ses collègues décrivent une méthodologie similaire au protocole décrit ci-dessous, dans leur description de dosages ostéoclastogéniques à partir de cellules de la moelle osseuse de souris. Cependant, pour libérer les cellules de la moelle osseuse après la récolte des os longs, Xing et al. Vider la cavité médullaire d&#39;α-MEM milieu complet14. Catalfamo examine l&#39;effet de l&#39;hyperglycémie sur la fonction des ostéoclastes et décrit un procédé dans lequel toutes les cellules mobilisées rinçage de la moelle osseuse par des sont cultivées pendant 24 heures, après quoi les cellules non adhérentes sont éliminées 12, une technique également utilisée par Boyle et al . 9 Ces protocoles publiés précédemment nécessitent la pratique de la chasse d&#39;eau de la moelle osseuse, une pratique fastidieux, qui présente aussi le risque d&#39;une blessure par piqûre d&#39;aiguille et de la perte de valeur de la moelle osseuse, comme on doit couper les deux extrémités de l&#39;os. Le protocole, que nous décrivons, met en oeuvre l&#39;utilisation d&#39;un mortier et d&#39;un pilon pour isoler les ostéoclastes, qui est similaire à la méthode d&#39;isolement de macrophages décrit par Weischenfeldt 15 et al. Notre expérience, cependant, est que l&#39;isolement des ostéoclastes et la culture in vitro en utilisant les résultats des techniques déjà publiés dans les résultats variables en termes de production des ostéoclastes, ce qui entraîne souventune incapacité à cultiver les ostéoclastes. Par conséquent, nous avons mis au point un protocole qui permet l&#39;isolement compatible de moelle osseuse de souris pour produire un grand nombre d&#39;ostéoclastes multinucléés in vitro, avec un rendement approximatif de 70 à 80% des cellules plaquées initialement la formation d&#39;ostéoclastes et des macrophages par la suite, en présence de médias ostéoclastes à induction.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1017">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:503px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:165px;">Company</td>
			<td style="width:175px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51200-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-CSF, recombinant mouse</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PMC2044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>462-TEC-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostaglandin E2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3987</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

osteoclast derivation from mouse bone marrow

<html> Les ostéoclastes sont des cellules hautement spécialisées qui sont dérivés de la lignée des monocytes / macrophages de la moelle osseuse. Leur capacité unique à se résorber à la fois les matrices organiques et inorganiques de l&#39;os signifie qu&#39;ils jouent un rôle clé dans la régulation de remodelage osseux. Ensemble, les ostéoblastes et les ostéoclastes sont responsables du processus de couplage dynamique qui implique à la fois la résorption osseuse et la formation osseuse agissant de concert pour maintenir le squelette normal pendant la santé et la maladie. Comme la cellule principale de résorption osseuse dans le corps, des changements dans la différentiation ou la fonction des ostéoclastes peuvent entraîner des effets profonds dans le corps. Les maladies associées à la fonction des ostéoclastes modifié peut varier dans la sévérité de la maladie néonatale létale due à l&#39;échec à former un espace de moelle pour l&#39;hématopoïèse, à des pathologies telles que l&#39;ostéoporose, dans lequel excessive résorption osseuse ostéoclastique prédispose aux fractures formation plus couramment observé. ent &quot;&gt; Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre in vitro a permis des avancées significatives dans la compréhension du cycle de remodelage osseux et a ouvert la voie à la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques qui luttent contre ces maladies. Ici, nous décrivons un protocole pour isoler et cultiver les ostéoclastes de moelle osseuse de souris qui donnera un grand nombre d&#39;ostéoclastes.

<html> Le but de cette méthode est d&#39;isoler facilement un grand nombre d&#39;ostéoclastes in vitro, typiquement en une semaine. Isolation réussie d&#39;un grand nombre d&#39;ostéoclastes a été confirmée en utilisant la phosphatase acide tartrate de coloration résistant (Figure 1A). Pour les ostéoclastes sont visualisées en tant que grandes cellules pourpres avec de multiples noyaux (typiquement ≥ 3 noyaux). En utilisant ce protocole, il est fréquent d&#39;isoler les ostéoclaste...

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Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Les ostéoclastes sont des cellules du capital de résorption osseuse dans le corps. Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre a conduit à des avancées significatives dans la compréhension de la biologie des ostéoclastes. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour l&#39;isolement, la culture et la quantification de l&#39;activité des ostéoclastes in vitro.

Ostéoclastes Dérivation de moelle osseuse de souris

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

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24.0K vues.  Stanford University School of Medicine.  Les ostéoclastes sont des cellules du capital de résorption osseuse dans le corps. Une capacité à isoler les ostéoclastes en grand nombre a conduit à des avancées significatives dans la compréhension de la biologie des ostéoclastes. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour l'isolement, la culture et la quantification de l'activité des ostéoclastes in vitro. 

Vidéo: Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

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Biologie

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Culture de cellules dendritiques myéloïdes à partir de précurseurs de moelle osseuse

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La préparation des cultures primaires de cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse murine pour l&#39;électroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow. Various chemomkines and receptors are involved in the homing of hematopoietic stem cells. [1, 2]
This paper outlines the classic homing protocol used in hematopoietic stem cell studies. In general this involves isolating the cell population whose homing needs to be investigated, staining this population with a dye of interest and injecting these cells into the blood stream of a recipient animal. The recipient animal is then sacrificed at a pre-determined time after injection and the bone marrow evaluated for the percentage or absolute number of cells which are positive for the dye of interest. In one of the most common experimental schemes, the homing efficiency of hematopoietic cells from two genetically distinct animals (a wild type animal and the corresponding knock-out) is compared. This article describes the hematopoietic cell homing protocol in the framework of such as experiment.

This article describes a protocol used to study the homing of hematopoietic cells to their niches in the bone marrow.

Homing des cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolement et la dérivation de cellules germinales embryonnaires de souris

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Dérivation de cellules souches de la souris Trophoblast à partir de blastocystes

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

Isolement, purification et différenciation des précurseurs d’Ostéoclast de la moelle osseuse de rat

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Proplatelet Formation Dynamics of Mouse Fresh Bone Marrow Explants

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the proplatelet formation using in vitro-differentiated megakaryocytes; however, there is an increasing evidence that conventional culture systems do not faithfully recapitulate the differentiation/maturation process that takes places inside the bone marrow. In this manuscript, we present an explant method initially described in 1956 by Thi&#233;ry and Bessis to visualize megakaryocytes which have matured in their native environment, thus circumventing potential artifacts and misinterpretations. Fresh bone marrows are collected by flushing the femurs of mice, sliced into 0.5 mm cross sections, and placed in an incubation chamber at 37 &#176;C containing a physiological buffer. Megakaryocytes become gradually visible at the explant periphery and are observed up to 6 hours under an inverted microscope coupled to a video camera. Over time, megakaryocytes change their shape, with some cells having a spherical form and others developing thick extensions or extending many thin proplatelets with extensive branching. Both qualitative and quantitative investigations are carried out. This method has the advantage of being simple, reproducible, and fast as numerous megakaryocytes are present, and classically half of them form proplatelets in 6 hours compared to 4 days for cultured mouse megakaryocytes. In addition to the study of mutant mice, an interesting application of this method is the straightforward evaluation of the pharmacological agents on the proplatelet extension process, without interfering with the differentiation process that may occur in cultures.

Here, we detail the bone marrow explant method, from sample preparation to microscopic slide analysis, to evaluate the ability of megakaryocytes which have differentiated in their physiological environment to form proplatelets.

Dynamique de formation proplaquettaire des explants de moelle osseuse fraîche de souris

The last stage of megakaryopoiesis leads to cytoplasmic extensions from mature megakaryocytes, the so-called proplatelets. Much has been learned about the ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

In Vivo Imagerie à deux photons de mégacaryocytes et de proplaquettaires dans la moelle osseuse du crâne de souris

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...