Ce protocole représente un essai fonctionnel in vitro utilisant des cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins pour mesurer l’immunogénicité du vaccin avant les études in vivo. Par conséquent, combler une lacune existante dans la vaccinologie du bétail. C’est la génération et l’application de cellules dendritiques.
En tant que cellules présentatrices d’antigènes les plus puissantes, les cellules dendritiques sont devenues une cible de recherche clé pour comprendre les mécanismes immunitaires intracellulaires, y compris l’efficacité du vaccin. Ce test peut être mis en œuvre comme outil de sélection des candidats vaccins, comme état de contrôle de la qualité pour la production de vaccins et pour la sélection des antigènes et des adjuvants. Richard Kangethe, scientifique au laboratoire de production et de santé animale, fera la démonstration de la procédure.
Commencez par inverser et mélanger le sang obtenu à partir de la ponction de la veine jugulaire du veau avec des vacutainers héparinisés. Ensuite, transférez 20 millilitres de sang hépariné dans un tube stérile de 50 millilitres et diluez-le avec 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate ou PBS. Pipeter 15 millilitres de milieu d’isolation lymphocytaire dans un tube stérile de 50 millilitres et incliner le tube à une position de 45 degrés.
Déposer soigneusement 30 millilitres de milieu PBS sanguin sur l’isolement lymphocytaire à l’aide d’une pipette de 25 millilitres et ramener lentement le tube en position verticale avant de le centrifuger. Ensuite, collectez la fine couche blanche de cellules mononucléées du sang périphérique ou de la couche PBMC à l’aide d’une pipette Pasteur et transférez-la dans un nouveau tube de 50 millilitres. Lavez les PBMC récoltés deux fois en utilisant 40 millilitres de PBS par lavage et mélangez-les soigneusement.
Après centrifugation, remettre la pastille en suspension dans 15 millilitres de tampon potassium et de chlorure d’ammonium ou de tampon ACK. Après 10 à 15 minutes d’incubation à température ambiante, ajoutez jusqu’à 40 millilitres de PBS et centrifugez le tube avec une accélération et une décélération maximales. Remettez en suspension la pastille dans 10 millilitres de milieu de culture complet.
Ajoutez ensuite cinq microlitres de tampon MicroBead CD14 par 10 millions de cellules et mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette. Pour l’analyse par cytométrie en flux, ajoutez 10 microlitres d’isothiocyanate de fluorescéine CD14 ou d’anticorps colorant FITC aux PBMC et incuberez-le pendant 15 minutes à quatre à huit degrés Celsius avant de procéder à la cytométrie en flux. Aux PBMC non tachés, ajoutez un millilitre de tampon de fax et centrifugez-le pendant sept minutes à 500g et quatre degrés Celsius.
Ensuite, remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon fax pour 100 millions de cellules. Ensuite, insérez la colonne de séparation cellulaire immunomagnétique dans le séparateur et placez un tube de collecte de 50 millilitres sous la sortie de la colonne pour recueillir le flux. Après avoir lavé la colonne avec un tampon fax dégazé d’un millilitre, remplacez le tube de 15 millilitres usagé par un nouveau.
Pipeter cent millions de cellules dans 500 microlitres de tampon à la fois permettant à la suspension cellulaire de passer à travers la colonne. Rincez ensuite la colonne trois fois avec trois millilitres de tampon fax dégazé à chaque fois. Après avoir recueilli le flux, étiqueter la première fraction lymphocytaire naïve éluée comme fraction cellulaire CD14 négative.
Retirez la colonne du séparateur et placez un nouveau tube stérile de 15 millilitres sous la colonne pour la collecte des effluents. Ajoutez cinq millilitres de tampon de fax dans la colonne et poussez-la immédiatement à l’aide du piston. Recueillir et étiqueter la deuxième fraction monocytaire à flux continu ou naïve comme la fraction cellulaire positive CD14.
Ajouter un milieu de culture complet aux monocytes CD14 positifs récoltés pour atteindre 1 million de cellules par millilitre. Ensuite, ajoutez une suspension cellulaire d’un millilitre à chaque puits d’une plaque stérile de 24 puits avant de compléter chaque puits avec 40 microlitres du cocktail de cytokines fourni dans le kit. Le deuxième jour, transférez la moitié du contenu de chaque puits dans des tubes individuels de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette.
Après avoir centrifugé les tubes de 1,5 millilitre à 500 g pendant sept minutes, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de milieu de culture complet frais. Transférez 500 microlitres de cette suspension cellulaire remise en suspension dans les puits correspondants afin que le volume final dans le puits devienne un millilitre. Enrichissez chaque puits avec 20 microlitres de cocktail de cytokines.
Pour générer des MoDC pulsés d’antigène, ajoutez un microlitre par millilitre de vaccin antirabique ou de suspension de RV à un millilitre de culture de MoDC naïf dans la plaque de 24 puits et incuber la plaque pendant 48 heures à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius. Le septième jour, conservez la plaque de 24 puits contenant les MoDC pulsés d’antigène sur la glace pendant 10 minutes avant d’ajouter un millilitre de PBS glacé par puits et de bien mélanger. Transférer la suspension dans un tube de 15 millilitres.
Lavez les puits avec deux millilitres de PBS glacé. Recueillir les cellules résiduelles dans chaque puits et transférer le contenu lavé dans leurs tubes respectifs. Centrifuger la suspension cellulaire à 500g pendant sept minutes.
Après avoir éliminé le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire MoDCs pulsée d’antigène dans un milieu de culture complet pour ajuster la concentration finale de 100 000 cellules par millilitre. Pour la co-culture MoDC-lymphocyte, ensemencer les puits d’une plaque stérile de 24 puits avec un millilitre de suspension de cellules lymphocytaires naïves et un millilitre de suspension MoDC pulsée ou non antigénique le septième jour de l’impulsion antigénique. Après deux jours d’incubation, complétez chaque puits avec 20 nanogrammes par millilitre d’interleukine-2 recombinante et poursuivez l’incubation pendant 120 heures supplémentaires.
Le jour 14, transférer un millilitre de co-culture dans un tube stérile de 1,5 millilitre et centrifuger le tube. Ensuite, remettez en suspension la pastille cellulaire avec un millilitre de MoDC pulsés ou non pulsés d’antigène. Bien mélanger et transférer les suspensions cellulaires dans leurs puits correspondants.
Après coloration à la surface cellulaire des PBMC et des lymphocytes et monocytes naïfs, transférer un millilitre de la suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 millilitre à l’aide d’une pipette et d’une centrifugeuse pendant 10 minutes à 500 g. Ensuite, remettez la pastille en suspension dans un millilitre de PBS et transférez-la dans un tube de 15 millilitres. Collectez également les cellules résiduelles et les tubes correspondants en utilisant un millilitre de PBS.
Ajoutez ensuite 10 millilitres de PBS au tube de 15 millilitres contenant les cellules et mélangez par pipetage. Après avoir centrifugé le tube pendant sept minutes à 850 g, retirer le surnageant et remettre délicatement en suspension la cellule avec la suspension résiduelle laissée après la décantation du surnageant. Transférer la suspension cellulaire sur une plaque à fond en V à 96 puits et sceller les puits pour éviter les déversements.
Une fois la coloration terminée, effectuez l’analyse du cytomètre en flux. À partir de l’aperçu en temps réel, ajustez le seuil de fluorescence, y compris la tension, le gain et la taille de la cellule pour éventuellement tracer des portes autour de la population cellulaire souhaitée tout en excluant tout débris cellulaire. La coloration des cellules CD14 et la cytométrie en flux ont montré que la fraction monocytaire naïve comprenait 98% de cellules monocytaires CD14 positives et était fonctionnellement capable d’absorption de l’antigène.
Les MoDCs naïfs phénotypiquement caractérisés par l’évaluation de l’expression du CMH de classe 2 et les marqueurs de surface cellulaire CD86 et CD40 co-stimulateurs ont validé les cellules dendritiques ou le phénotype DC-like. Au cours de la co-culture lymphocytaire MoDC le neuvième jour, un changement morphologique montrant une extension de dendrite a été observé dans l’impulsion RV vers MoDCs. Par rapport à la culture de lymphocytes MoDC non pulsés, une augmentation significative de la prolifération lymphocytaire a été démontrée par la régulation positive des marqueurs d’activation Ki67 et CD25 sur les lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs au jour 16 dans la co-culture de lymphocytes MoDC pulsés.
Les lymphocytes T CD8 positifs des co-cultures MoDC pulsées RV matures ont présenté une régulation positive huit fois supérieure de Ki67 par rapport au groupe non spécifique. Les cellules CD4 positives dans la même co-culture ont montré une multiplication par sept de Ki67 par rapport aux témoins, démontrant la capacité des MoDC amorcés par le RV à présenter l’antigène du RV aux lymphocytes naïfs et à les activer in vitro. La quantification qPCR des co-cultures a montré une augmentation de plus de 30% de l’expression de l’interféron gamma et une augmentation de plus de 5% de l’expression de Ki67 dans toutes les co-cultures utilisant GAPDH comme calibrateur.
Une concentration significativement plus élevée d’interféron gamma sécrété a été observée dans la co-culture de lymphocytes MoDC pulsés RV par rapport au groupe de traitement non spécifique. Effectuez l’étape de stratification très lentement et soigneusement, en veillant à ce que le sang soit déposé sur le milieu d’isolement des lymphocytes. Faites très attention à collecter tous les PBMC sans collecter trop de matière des autres couches.
D’autres méthodes telles que la cytométrie en flux, ELISA et la PCR quantitative, entre autres, peuvent être appliquées après cette procédure pour évaluer l’activation des marqueurs immunitaires.
