Les réponses neuronales donnent un aperçu de l’activité cérébrale, mais peuvent varier selon les expériences et les individus. Ce protocole aide en automatisant l’enregistrement et l’analyse des stimulations, et en simplifiant la programmation des différents types et modèles de stimuli. La technique automatisée permet d’enregistrer en parallèle plusieurs neurones et organismes dans le même format microfluidique.
Cela améliore la répétabilité des enregistrements et permet d’explorer la variabilité neuronale entre les populations. Différents modèles de stimulation sont nécessaires pour révéler des phénomènes neuronaux tels que l’adaptation et l’intégration sensorielle. Cette méthode est généralisable à d’autres signaux dynamiques des cellules et organoïdes aux organismes et aux plantes.
Pour commencer, allumez le microscope, remplissez et retirez les bulles d’air du tube du réservoir à l’aide de la seringue d’amorçage, puis remplissez le tube de sortie avec un tampon. Retirez le dispositif microfluidique du dessiccateur à vide. Placez l’appareil sur le microscope et insérez rapidement le tube de sortie.
Appuyez doucement sur la seringue de sortie pour injecter du liquide dans l’appareil jusqu’à ce qu’une gouttelette sorte d’une entrée. À cette entrée de gouttelettes levées, utilisez un raccord goutte-à-goutte pour insérer le tube d’entrée fluidique correspondant, en veillant à ce que des gouttes de liquide soient présentes à la fois sur le tube d’entrée et le hublot de l’appareil pour éviter l’introduction d’une bulle. Connectez le tube d’entrée suivant à la gouttelette suivante.
Injectez plus de liquide de la sortie si nécessaire et répétez jusqu’à ce que toutes les entrées soient remplies. Insérez une goupille de blocage solide aux entrées inutilisées et au port de chargement de la vis sans fin. Vérifiez le flux à l’écran pour vous assurer que le flux va dans la direction souhaitée.
Tournez la vanne sur le contrôleur de la vanne et observez le flux de stimulus qui s’écoule dans l’arène microfluidique. Si le débit est déséquilibré, ajustez les hauteurs du réservoir. Transférer les jeunes animaux adultes sur un milieu de croissance de nématodes non ensemencé ou une plaque de gélose NGM à l’aide d’un pic à embout métallique, puis inonder la plaque avec environ cinq millilitres d’un tampon basal XS afin que les animaux puissent nager.
Aspirez les vers dans une seringue de chargement d’un à trois millilitres à l’aide du tube fixé prérempli d’un tampon basal XS. À l’aide d’un stéréoscope, déplacer le tube sous la surface du liquide avec une main vers chaque animal désiré et l’aspirer dans le tube à l’aide de la seringue tenue dans l’autre main. Fermez le contour de la prise, retirez la broche de chargement du ver et connectez la seringue de chargement du ver au périphérique à l’aide d’une connexion goutte-à-déposer.
Ensuite, coulez doucement les animaux dans l’arène. Établir un débit tampon et prévoir jusqu’à une heure pour l’immobilisation par tétramisole. À l’aide de l’éditeur de texte, créez un fichier texte de définition de stimulus nommé userdefinedacquisitionsettings.
TXT contenant les paramètres de stimulation pour l’acquisition automatisée d’images. Ce fichier définit les paramètres d’acquisition du microscope tels que le moment de l’exposition et de l’excitation, la durée de l’essai, les intervalles et le répertoire de sauvegarde. Il définit également le type d’expérience et les paramètres de synchronisation de la stimulation.
Pour une seule expérience de stimulation, utilisez un format avec une seule commande de stimulation répétée. Pour une expérience à motifs multiples, utilisez un format avec plusieurs commandes de stimulation en incluant une séquence de chiffres de motif qui représente l’ordre des modèles de stimulus. Pour chaque motif, entrez une commande de stimulation sur une ligne distincte.
Ensuite, exécutez le logiciel de contrôle du microscope. Vérifiez que toutes les entrées fluidiques sont ouvertes, que le flux est souhaité dans l’arène et que les neurones d’intérêt sont concentrés dans la fenêtre en direct. Fermez ensuite la fenêtre active et exécutez le script multipatternrunscript.
BSH dans le logiciel. Pour analyser les données, exécutez NeuroTracker en cliquant séquentiellement sur les plugins, puis sur le suivi, puis sur NeuroTracker. Sélectionnez le dossier contenant les fichiers vidéo tiff à suivre et sélectionnez la plage de fichiers à traiter.
Ensuite, à l’aide des menus Image et Réglage, ouvrez les fenêtres de contrôle du contraste de luminosité et du seuil. Vérifiez l’arrière-plan sombre et ne réinitialisez pas la plage dans la fenêtre de seuil, en définissant la méthode de seuillage sur la valeur par défaut et la visualisation sur rouge. Cliquez ensuite sur auto dans la fenêtre de contraste de luminosité pour la visibilité des neurones.
Dans la fenêtre de contraste de luminosité, ajustez les curseurs minimum et maximum jusqu’à ce que les neurones soient clairement distinguables. Ajustez ensuite le niveau de seuil jusqu’à ce que tous les neurones apparaissent comme de petites taches rouges séparées des autres objets. Ajustez le curseur du cadre pour observer le mouvement des neurones et les changements d’intensité, en notant les animaux à exclure du suivi, par exemple en raison d’un chevauchement avec d’autres animaux.
Après avoir identifié les neurones à suivre, ajustez le niveau de seuil pour chaque animal si nécessaire, de sorte que la zone de seuil rouge au-dessus du neurone soit visible dans chaque image. Cliquez sur le neurone pour enregistrer sa position et son niveau de seuil. Lorsque tous les neurones sont sélectionnés, appuyez sur la barre d’espace pour commencer le suivi.
Surveillez le processus de suivi de chaque animal et apportez les corrections nécessaires. Si NeuroTracker fait une pause, il perd le neurone. Ajustez le niveau de seuil au besoin et cliquez à nouveau sur le neurone.
Si la boîte d’intégration saute à un autre animal voisin ou à une structure non neuronale, appuyez sur la barre d’espace pour faire une pause. Replacez le curseur sur la première image erronée et cliquez à nouveau sur l’emplacement correct du neurone. Exécutez le neurotrackersummarypdf.
m dans MATLAB et sélectionnez le dossier contenant les fichiers texte de données NeuroTracker. Attendez qu’un PDF récapitulatif soit généré, permettant de vérifier le processus de suivi. Les animaux peuvent être identifiés par les nombres et les réponses neuronales de chaque animal et essai et être vus pour évaluer la variabilité de la population.
Utilisez la fonction databrowse. m pour explorer les données neuronales regroupées par numéro d’essai, nombre d’animaux, modèle de stimulation ou par autre catégorie. Le phénomène d’inhibition temporelle a été testé dans une expérience d’impulsion appariée qui a produit huit modèles consistant en deux impulsions odorantes d’une seconde séparées par un intervalle allant de zéro à 20 secondes.
La première impulsion olfactive d’une seconde a provoqué une amplitude de réponse égale dans les neurones AWA détectant le diacétyle et les réponses dans la deuxième impulsion variaient avec l’intervalle inter-stimulus. La désinhibition a été évaluée par l’expérience d’essai de capture où une adaptation a été observée au stimulus du diacétyle, mais la présentation du nouveau stimulus de la 2-méthylpyrazine n’a pas provoqué un fort effet de désinhibition. La stimulation multimodale testée a révélé que la stimulation chimique seule provoquait une adaptation alors que la stimulation optique seule ne le faisait pas.
Cependant, le schéma de stimulus multimodal combiné a démontré que les réponses optogènes étaient sensibles à l’adaptation induite chimiquement. En modifiant la conception microfluidique pour inclure deux arènes, nous pouvons comparer les perturbations génétiques ou autres à côté d’une référence appariée en même temps. Une fois configuré, le système peut être modifié de plusieurs façons.
Par exemple, nous avons automatiquement mesuré les réponses aux doses chimiques et les changements de l’activité neuronale dépendants de l’état, tels que les états de sommeil et d’éveil.
