Je remercie L Watanabe, M Gorczyca et d&#39;autres membres du laboratoire Yoshihara pour des commentaires utiles et de discussion. Je remercie K. Scott et L. Looger pour les stocks de mouches, S Yokoyama pour démontrer les expériences, Shinya Iguchi de l&#39;aide technique, et Nobuko Yoshihara l&#39;information importante. Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut national de subventions en santé mentale MH85958, et la Fondation Worcester pour MA

1. Construire les MOUCHES <ol><li> Façonner une plate-forme du couvercle de 35 mm Falcon plat par fusion de la paroi latérale et découper pour former un angle approprié et l&#39;épaisseur (figure 1a; figure 2). Percez un trou dans la plate-forme d&#39;accepter la tête à la mouche (Figure 1a, b), de telle sorte que les pièces buccales sont librement exposée à l&#39;extérieur de la chambre (Figure 1a). Coupez l&#39;extrémité d&#39;une pointe de Pipetman, avec la taille correspondant à la volée pour être observée. Collez le bout de la plate-forme comme le montre la figure 1a pour compléter des mouches (Figure 2). </li></ol> 2. Préparation de la mouche pour l&#39;observation <ol><li> Mourir de faim une mouche adulte pendant 24 heures à 25 ° C avant l&#39;expérience en la plaçant dans un flacon avec seulement une serviette en papier humide, si la famine est nécessaire. </li><li> Anesthésier la volée en le plaçant dans un tube en plastique 15ml debout sur la glace. </li><li> En utilisant le forceps, insérez une mouche dans la chambre de l&#39;MOUCHES, et poussez doucement la volée jusqu&#39;à ce qu&#39;elle soit incapable de se déplacer. Ensuite, insérez un bouchon pour conserver la volée. (Figure 1a, b). </li><li> Sceller les parties environnantes de la trompe proximale (rostre) vers le bord interne du trou; Appliquez une petite quantité de la lumière La colle (Tetric EvoFlow) sur les côtés et au-dessus de la tribune de l&#39;extérieur (flèches dans la figure 3). Appliquer la colle également de l&#39;intérieur des MOUCHES à l&#39;espace entre la partie dorsale de la tête et le bord intérieur du trou (figure 1b). Afin de permettre à la tribune pour se déplacer librement, les soins devraient être prises pour empêcher la colle de toucher la tribune à l&#39;aide d&#39;un cil (ou quelque chose de comparable) pour étendre la colle. Enfin, durcir la colle avec le plus faible éclairement de la lumière bleue suffisante pour guérir pour éviter d&#39;endommager la mouche de la chaleur excessive. Retirez le bouchon. </li><li> Un fil de tenir la tribune partiellement levé (flèche dans la figure 3) peuvent être utilisés pour stabiliser la volée »la tête s en évitant la bosse de la partie du pharynx à la SOG et d&#39;exposer la partie ventrale de la SOG, en particulier pour les terminaux d&#39;imagerie pré-synaptiques de neurones Gr5a 8, qui sont couverts par une partie du pharynx lors de la trompe est complètement rétractée. </li><li> Remplir la surface de la plate-forme avec un sucre contenant une solution saline sans (en mM): NaCl, 140; KCl, 2; MgCl 2, 4,5; CaCl 2, 1,5, et HEPES-NaOH, 5 avec un pH de 7,1 10. Cette solution saline sans sucrose a tonicité semblables à celles de couramment utilisé saccharose-salines contenant comme HL3.1 11. </li><li> Ouvrir la capsule tête à l&#39;aide d&#39;une lame de tungstène et une pince avec des conseils affûtés comme des ciseaux, ce qui est un dispositif sur mesure et conçu à l&#39;origine par le Dr Kageyuki Yamaoka, le Japon, pour couper la cuticule et de la trachée afin d&#39;exposer la SOG (Figure 4). Le bord ventral de la cuticule tête a été coupée comme ventrale que possible alors que la coupe bord dorsal n&#39;était pas aussi critique. Tout d&#39;abord, faire une incision à travers laarête postérieure en utilisant une lame de tungstène. Ensuite, couper à travers le côté et les bords antérieurs utilisant des pinces acérées. La pièce cuticule coupe devraient être levées avec la pince et retiré. Nerfs Antennes et antennes doivent être coupés par des pinces acérées. </li><li> Afin d&#39;éviter des artefacts de mouvement pendant les enregistrements, le cerveau doit être stabilisée grâce à la suppression de certaines parties de la mouche. Tout d&#39;abord, éliminer sélectivement des sacs d&#39;air entre le SOG et les cuticules. Coupez l&#39;œsophage à la fin vers le pharynx et à la fin va dans la SOG pour supprimer la connexion entre le pharynx et le cerveau. Tirez ensuite Muscle 16 12, et enfin, détachez tout trachée reliant le cerveau et la cuticule. </li><li> Nous avons mis nos mouches sur la scène d&#39;un microscope Olympus BX51WI connecté à un système de microscope confocal disque en rotation (Improvision dans PerkinElmer) (Figure 5). Une lentille immersion dans l&#39;eau, par exemple 40X/0.8 NA, a été immergé dans le bain (figure 6 </strong&gt;). </li></ol> 3. Ca 2 + l&#39;imagerie du cerveau <ol><li> Ca 2 + imagerie utilisant GCaMP3.0 1, 9 a été réalisée par le procédé mis en place par Marella et al. 8 (figure 6). En utilisant un microscope confocal disque en rotation (Improvision), prenez une seule section optique à 4Hz avec un temps d&#39;exposition de 122ms en utilisant 491nm laser d&#39;excitation, se concentrant dans la région d&#39;intérêt (un corps cellulaire d&#39;un neurone moteur, ou un interneurone, ou terminaisons présynaptiques des neurones sensoriels gustatifs) avec le logiciel Velocity, v. 4.3 (Improvision). </li></ol> 4. Stimuler les Proboscis <ol><li> Aspirer une solution de saccharose à 100 mM aqueuse dans une aiguille hypodermique avec une mèche de petite taille (fabriqués à partir de washi papier Japon, tableau de réactifs spécifiques) faisant saillie de la pointe (figure 7). </li><li> Décharge d&#39;une petite goutte de solution de saccharose sur la mèche, puis, l&#39;aspirer, immédiatement before l&#39;application de la mèche de papier imbibée Washi à la pointe de la trompe. La mèche de papier Washi devrait être appliquée que pour un instant afin d&#39;éviter la satiété (figure 8). Surveiller la réponse extension du proboscis (PER) comportement en utilisant une caméra CCD attaché à un microscope à dissection (figure 5) simultanément avec le Ca 2 + imagerie. Les données doivent être prises dans l&#39;heure après le début de la dissection, car la réponse PER n&#39;est pas maintenue plus d&#39;une heure dans ces conditions. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Les neurones moteurs de la tribune rapporteur, une paire de muscles principaux responsables de la levée de la tribune pour extension du proboscis, ont été signalés à montrer des réponses robustes à des stimuli sucrés 13. Montre la figure 9 Ca 2 + par le biais de signaux GCaMP3.0 1, 9 exprimé par un Ga 4, pilote, E49 13, à partir d&#39;un corps cellulaire du neurone moteur. Comme le montre la vidéo, un Robur PAR a été observée en synchronisme avec une augmentation de Ca 2 + du signal. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de la mouche du cerveau en direct d&#39;imagerie et d&#39;électrophysiologie étape (mouches). une, les mouches est construit de telle sorte que l&#39;angle de la paroi permet la tête mouche à sortir droite. Trois segments de la trompe mouche sont codés par couleur; la tribune est le magenta. La mouche est inséré dans la chambre avec une pince, et une découpe de l&#39;extrémité d&#39;une pointe Pipetman est branché à l&#39;arrière de la chambre pour bloquer la volée de s&#39;échapper. B, Le trou est percé afin de se conformer à la tête de la mouche. Les lacunes qui subsistent sont scellés avec de la lumière La colle comme indiqué pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de fuites. Une fois la colle durcie, la pointe Pipetman comme un bouchon est enlevé. Saline est versé dans les MOUCHES telles que la surface du cerveau est complètement recouverte. Il devrait être assuré qu&#39;il n&#39;y a pas de fuite une solution salinetution de sur l&#39;extrémité antérieure de la tête à la mouche. La zone ombragée par la ligne pointillée dans le panneau b montre la pièce à être disséqués. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> Figure 2. Photographie des MOUCHES. La paroi en forme de croissant de colle (à partir d&#39;un pistolet à colle) est réalisé pour commander l&#39;écoulement de solution saline pendant la perfusion, et pour réduire la quantité de solution saline utilisé. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> Figure 3. Vue frontale d&#39;une mouche montée dans les MOUCHES. Cette image montre comment une mouche se trouve dans les MOUCHES, et comment la colle photopolymérisable est appliquée autour de la tête de la mouche (flèches) pour créer un joint de solution saline preuve. Si des fuites salines par les proboscis de la mouche, puis l&#39;expérience va échouer. Le fil (flèches) attaché à l&#39;étape a pour maintenir la trompe en position, de sorte qu&#39;il n&#39;est pas complètement rétraction<html> Ted. Sinon, il risque d&#39;entraver la partie la plus ventrale du SOG et causer des artefacts de mouvement. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> Figure 4. Haut-tenu des mouches avec une mouche disséquée. Cette image montre l&#39;exposé d&#39;un SOG enlever les cuticules volée suivante. L&#39;œsophage, Muscle 16 et trachées relié au cerveau, ainsi que certains de l&#39;air des sacs ont également été supprimés pour les empêcher de perturber le cerveau, qui peut conduire à des artefacts dans les signaux calciques. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> Figure 5. Appareil de surveillance. Ce dispositif est assemblé à partir d&#39;un microscope Olympus BX51WI attaché à un système de microscope confocal disque tournant (Improvision), et un montage latéral Nikon SMZ800 microscope. Cette configuration permet l&#39;imagerie en direct de l&#39;activité cérébrale durant PAR comportement. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; Figure 6. Des photographies pour montrer le côté-vue des mouches. La fine couche de solution saline est pris en sandwich entre le 40X immersion dans l&#39;eau la lentille et la volée. <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> Figure 7. Schéma pour la fabrication de la mèche de papier Washi. Gampi-papier washi est un parchemin traditionnel japonais qui est extrêmement mince et lisse (Haibara, Japon). Il est également très forte et peut conserver une grande quantité de liquide. Le papier Washi doit être coupée en un trapèze avec des dimensions très spécifiques; 0,3 mm et 0,7 mm de largeur, et 4-5 mm de longueur (a). Ce trapèze est ensuite inséré depuis le côté 0,7 mm dans la pointe d&#39;une aiguille hypodermique 23 U et peut également être stabilisé par l&#39;insertion d&#39;une broche d&#39;insecte, qui est courbée à une forme en V (b). C, Le papier Washi devient transparente après l&#39;expositionà un liquide, le rendant idéal pour cette expérience. <img alt="Figure 8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> Figure 8. Stimulation de la trompe sur les mouches avec du washi-mèche. La mèche de papier Washi à la pointe d&#39;une aiguille hypodermique est appliqué pour un instant à l&#39;aide d&#39;un manipulateur Joystick avec une seule main. L&#39;aiguille est reliée à travers un tube flexible à manipuler avec un injecteur d&#39;autre part, pour aspirer et décharger une solution de saccharose. <img alt="Figure 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> Figure 9. Des résultats représentatifs. A, par le comportement enregistré par la caméra CCD installée sur le stéréomicroscope. Vue frontale de la mouche affamée avec une trompe étendues (flèches) avant la stimulation, à la stimulation, et après la stimulation d&#39;une mèche contenant 100 mM de solution aqueuse de saccharose (flèche). Éclairement est accomplie par un laser 491 nm utilisépour GCaMP fluorescence. b, saccharose induit GCaMP 3,0 réponse dans le neurone moteur pour le rapporteur du muscle tribune de l&#39;état famélique. Le panneau supérieur, avant la stimulation; le panneau inférieur, immédiatement après la stimulation. La barre d&#39;échelle, 10 um. C, la quantification de la réponse induite par le saccharose-GCaMP 3.0. Le neurone moteur répond à un stimulus de saccharose par une forte augmentation de la fluorescence suivie d&#39;une phase de restauration de plusieurs secondes à la ligne de base.

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	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 19, 137-141 (2001).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121, 141-152 (2005).</li><li>Schroll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae.">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 16, 1741-1747 (2006).</li><li>Hamada, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila.">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li><li>Peabody, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+decision+network+for+wing+expansion+in+Drosophila+using+targeted+expression+of+the+TRPM8+channel.">Characterization of the decision network for wing expansion in Drosophila using targeted expression of the TRPM8 channel.</a> J. Neurosci. 29, 3343-3353 (2009).</li><li>Dethier, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hungry Fly. , (1976).</li><li>Shiraiwa, T., Carlson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proboscis+Extension+Response+(PER)+Assay+in+Drosophila.">Proboscis Extension Response (PER) Assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (3), e193-e193 (2007).</li><li>Marella, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+taste+responses+in+the+fly+brain+reveals+a+functional+map+of+taste+category.">Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category.</a> 49, 285-295 (2006).</li><li>Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Yoshihara, M., Suzuki, K., Kidokoro, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+independent+pathways+mediated+by+cAMP+and+protein+kinase+A+enhance+spontaneous+transmitter+release+at+Drosophila+neuromuscular+junctions.">Two independent pathways mediated by cAMP and protein kinase A enhance spontaneous transmitter release at Drosophila neuromuscular junctions.</a> J. Neurosci. 20, 8315-8322 (2000).</li><li>Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+minimal+hemolymph-like+solution,+HL3.1,+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae.">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J. Neurogenet. 18, 377-402 (2004).</li><li>Miller, A., M, D. e. m. e. r. e. c. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> Biology of Drosophila. , 420-534 (1950).</li><li>Gordon, M. D., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+control+in+a+Drosophila+taste+circuit.">Motor control in a Drosophila taste circuit.</a> Neuron. 61, 373-384 (2009).</li><li>Yoshihara, M., Adolfsen, B., Galle, K. T., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+signaling+by+Syt+4+induces+presynaptic+release+and+synapse-specific+growth.">Retrograde signaling by Syt 4 induces presynaptic release and synapse-specific growth.</a> Science. 310, 858-863 (2005).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Je n&#39;ai rien à communiquer.</p

Les MOUCHES permet l&#39;enregistrement simultané de signaux Ca 2 + et le comportement PER. Même avec le cerveau exposé à une solution saline normale comportement PAR a été observée. Utilisation de la mèche Gampi-Washi au lieu d&#39;une mèche Kimwipe utilisé dans le method7 origine capillaire facilite un comportement hautement reproductible et stable PER et évite la nécessité d&#39;acquérir des compétences dans la fabrication et le choix d&#39;une mèche Kimwipe bonne. Les conseils expérimentales indiqué ci-dessus nous a permis de réussir à éviter les perturbations par le mouvement de la trompe, ce qui conduit à un enregistrement très stable de Ca 2 + signaux à faible bruit. De temps en temps, de tissus n&#39;était pas suffisant pour exposer des cellules ou supprimer le mouvement de manière adéquate, ce qui conduit à des résultats médiocres. Cependant, une fois que nous étions qualifiés, plus de 80% des préparations donné de bons résultats. Cette méthodologie n&#39;est pas seulement pour le Ca 2 + imagerie, mais peut aussi être adapté à n&#39;importe quelle imagerie en temps réel tout en observant le comportement PAR. Par exemple, nous pouvons accéder à n&#39;importe quelle cellule par l&#39;intermédiaire dul&#39;utilisation d&#39;une électrode d&#39;enregistrer directement l&#39;activité. Combiné avec la microscopie à deux photons d&#39;excitation, nous sommes en mesure de réaliser une imagerie laps de temps de la structure synaptique, qui peut être liée à des changements de comportement. Par conséquent, cette méthode de l&#39;imagerie cérébrale à l&#39;observation du comportement n&#39;est pas seulement précieuse pour la dissection fonctionnelle du réseau neuronal, mais pourrait être utilisé comme un outil puissant pour corréler 14 plasticité synaptique à des mécanismes sous-jacents de la mémoire.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de l&#39;équipement / Réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar Vivadent </td><td> M04115 </td><td> Photopolymérisable colle </td></tr><tr><td> Microscope BX51WI </td><td> Olympe </td><td> BX51WI </td><td> Avec 40X (NA 0,8) objectif immersion dans l&#39;eau </td></tr><tr><td> Spinning système de microscope confocal disque </td><td> Improvision dans PerkinElmer </td><td></td><td> Avec 491 nm laser </td></tr><tr><td> Stéréomicroscope </td><td> Nikon </td><td> SMZ-800 </td><td> Attaché à un bras oscillant. Vue stéréo est toujours disponible avec enregistrement vidéo </td></tr><tr><td> Gampi-papier washi </td><td> Haibara, le Japon </td><td></td><td> Un type spécial de papier japonais traditionnel </td></tr><tr><td> La caméra CCD </td><td> The Imaging Source </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1/2 &quot;1080 × 960 pixels SONY CCD </td></tr><tr><td> Manipulateur Joystick </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> Injecteur </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of drosophila melanogaster

Pour étudier des réseaux neuronaux en termes de leur fonction dans le comportement, nous devons analyser la façon dont les neurones fonctionnent lorsque chaque modèle de comportement est généré. Ainsi, des enregistrements simultanés de l&#39;activité neuronale et le comportement sont essentiels pour corréler l&#39;activité du cerveau au comportement. Pour ces analyses comportementales, la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, nous permet d&#39;intégrer des indicateurs de calcium génétiquement codés tels que GCaMP 1, pour surveiller l&#39;activité neuronale, et d&#39;utiliser les manipulations génétiques sophistiquées pour les techniques de optogénétique ou thermogénétique pour activer spécifiquement identifié les neurones 2-5. Utilisation d&#39;une technique thermogénétique nous a amené à trouver des neurones critiques pour le comportement alimentaire (Flood et al., En cours de révision). Comme une partie principale du comportement alimentaire, un adulte chez la drosophile s&#39;étend sa trompe pour alimenter 6 (réponse extension du proboscis; PER), répondant à un stimulus doux à partir de cellules sensorielles sur sa trompe ou tarses. Combining le protocole de PER 7 avec une technique d&#39;imagerie de calcium 8 à l&#39;aide GCaMP3.0 1, 9, j&#39;ai mis en place un système expérimental, où l&#39;on peut surveiller l&#39;activité des neurones dans le centre d&#39;alimentation - le ganglion oesophagien (SOG), simultanément avec l&#39;observation du comportement de la trompe. J&#39;ai conçu un appareil (&quot;Fly cerveau en direct d&#39;imagerie et d&#39;électrophysiologie du stade&quot;: &quot;LES MOUCHES&quot;) pour accueillir un adulte chez la drosophile, ce qui permet sa trompe pour se déplacer librement alors que son cerveau est exposé à la salle de bain pour le Ca 2 + imagerie à travers une lentille immersion dans l&#39;eau . Les MOUCHES convient également pour de nombreux types d&#39;expériences en direct sur le cerveau mouche telles que l&#39;enregistrement électrophysiologiques ou d&#39;imagerie laps de temps de la morphologie synaptique. Parce que les résultats de l&#39;imagerie en direct peut être directement corrélée avec le comportement simultanée PAR, cette méthodologie peut fournir un excellent système expérimental pour étudier traitement de l&#39;information des réseaux de neurones, et comment cela cactivité ellular processus est couplé à la mémoire et en plastique.

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Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

La mouche des fruits,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, S&#39;étend sa trompe pour se nourrir, de répondre à un stimulus sucre à partir de sa trompe ou du tarse. J&#39;ai combiné des observations de la réponse extension du proboscis (PER) avec une technique d&#39;imagerie de calcium, ce qui nous permet de surveiller l&#39;activité des neurones dans le cerveau, en même temps que l&#39;observation du comportement.

Enregistrement simultané des signaux calciques de neurones identifiés et le comportement alimentaire des Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

simultaneous-recording-calcium-signals-from-identified-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

15.5K vues.  University of Massachusetts Medical School. La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, S'étend sa trompe pour se nourrir, de répondre à un stimulus sucre à partir de sa trompe ou du tarse. J'ai combiné des observations de la réponse extension du proboscis (PER) avec une technique d'imagerie de calcium, ce qui nous permet de surveiller l'activité des neurones dans le cerveau, en même temps que l'observation du comportement.

Vidéo: Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Enregistrements Sensillum simple chez les insectes Drosophila melanogaster Et Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Recherche

Neurosciences

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marquage fluorescent rétrograde Permet ciblée extracellulaire seule unité d&#39;enregistrement de neurones identifiés<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Stimulation optogenetic de comportement de fuite en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Enregistrement de l&#39;activité électrique de neurones identifiés dans le cerveau intact des poissons transgéniques

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracellulaire enregistrement, le mappage des champs sensorielle, et la culture de neurones identifiés dans le Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Potentiel de membrane Dye Imaging de ventromédian hypothalamus neurones de souris adulte à étudier Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Un guide pour<em&gt; In vivo</em&gt; Simple unité d&#39;enregistrement de Optogenetically identifié corticale inhibitrice Interneurones

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforé patch-clamp enregistrement des souris neurones sensoriels olfactifs dans neuroépithélium Intact: Analyse fonctionnelle des neurones exprimant un récepteur odorant Identifié

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Enregistrement électrophysiologique de l’activité du système nerveux Central du troisième stade de Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...