Financé par la NSF (0854551).

1. Préparation pré-expérimentale <ol><li> Préparer les solutions suivantes (voir le tableau 1 pour les compositions): (a) 1 litre NFR (Ringer de grenouille normale), (b) une solution saline 100 ml 10%, (c) 100 ml CMF (Ca 2 + / Mg 2 + sans solution ), (d) 1 ml SA (Insulin-transferrine-Sélénium, Sigma I1884), (e) 100 ml de milieu L-15 de la culture, (f) 10 ml HCG (gonadotrophine chorionique humaine Sigma CG-10), (g) 100 ml K +-interne solution, (h) 100 ml K +-interne solution pour l&#39;amphotéricine B. La force osmotique de la solution 1 doit être vérifiée afin de s&#39;assurer qu&#39;elle est d&#39;environ 260 mOsm l&#39;aide d&#39;un osmomètre à pression de vapeur (p. ex Wescor modèle # 5100C) . </li><li> Stériliser par filtration des solutions (b) et (c). Les solutions (a) (b) et (c) peuvent être stockées jusqu&#39;à trois mois à 4 ° C. Préparer une solution (d) par addition de 1 ml d&#39;eau désionisée H 2 O dans le flacon contenant la poudre lyophilisée par une aiguille de calibre 25 et un filtre seringue seringue. Cette solution finale cun être conservés à 4 ° C pendant 30 jours. </li><li> Préparer une solution (E) dans une hotte à flux laminaire, en combinant tous les composants dans un bécher ou une fiole. Stériliser par filtration de la solution finale et transférer aliquotes de 10 ml dans des tubes à centrifuger stériles. Conserver à -20 ° C. </li><li> Préparer l&#39;HCG (solution (f)) en ajoutant 10 ml d&#39;eau désionisée H 2 0 dans le flacon contenant la poudre lyophilisée aide d&#39;une aiguille de calibre 25 seringue et d&#39;un filtre seringue. Cette solution finale peut être conservé à 4 ° C pendant 30 jours. </li><li> Fabriquer au moins deux outils de microdissection par collage d&#39;un axe minuties (26002-10, Outils Fine Science) à l&#39;extrémité d&#39;une pipette Pasteur en verre avec de la colle cyanoacrylate. Permettre à l&#39;extrémité pointue de la broche à s&#39;étendre au-delà de l&#39;extrémité de la pipette d&#39;environ 0,5 cm. </li><li> Deux jours avant la préparation des cultures, induire la reproduction à la procédure suivante. Identifier un couple reproducteur-prêt de Xenopus en observant un éminent, cloaque rougeâtre sur la pigmentation foncée des femmes et sur ​​le plan surface des pattes avant du mâle. Un à la fois, déduction faite chaque grenouille et maintenez-la face ventrale vers le bas sur un évier avec le filet de sorte qu&#39;il ne peut pas s&#39;échapper. Injecter 1 ml de solution (f) à travers le net et sous-cutanée dans des sacs lymphatiques dorsaux. </li><li> Placez le couple reproducteur ensemble dans un réservoir couvert dix litres d&#39;eau. Afin de s&#39;assurer que les animaux ne seront pas piétiner les oeufs fraîchement pondus et fertilisés, installer un plancher blindé avec un maillage d&#39;environ ½ &quot;équipés d&#39;environ 1-2 cm au-dessus du fond de la cuve (figure 1A). </li><li> Laisser grenouilles intactes pendant 12-48 h jusqu&#39;à ce que les animaux sont en amplexus les oeufs fertilisés sont observées à l&#39;étage inférieur de l&#39;écran (figure 1B). </li><li> Retirer les animaux de la citerne, mais laisser les œufs reposer pendant au moins 24 heures plus. Cette paire de grenouilles peuvent être réutilisés élevés après six semaines. </li><li> Desserrez les embryons du fond de la cuve et de les transférer à quatre ou cinq culte mm 60x15ure plats contenant une solution saline à 10% (solution B). Trier les embryons par étape selon le schéma de Niewkoop et Faber (réf. 20). Embryons utiles seront ceux au stade 22-24. Figure 2A montre un embryon au stade d&#39;environ 22, tandis que la figure 2B montre un embryon qui est trop loin dans le développement pour être utile (environ étape 28). Il est important de choisir les embryons qui sont en bonne santé: ceux qui sont d&#39;apparence lisse marron clair avec des marbrures blanches et sont idéales. Les embryons qui ont de grandes taches noires ou blanches sont généralement malsain et inutilisable. </li></ol> 2. Microdissection d&#39;embryons de xénope <ol><li> L&#39;intérieur d&#39;une hotte à flux laminaire, l&#39;étiquette et remplissez environ à mi-chemin trois plats 60x15 mm culture stériles avec une solution saline à 10%, et une avec FMC. </li><li> En utilisant une solution stérile, pipette Pasteur en verre transfert de cinq à dix étapes 22-24 embryons dans l&#39;une des boîtes contenant une solution saline à 10%. Avec l&#39;aide d&#39;un zoom stéréo disséquermicroscope ment intérieur de la hotte (0,6-5x avec oculaires x 10), enlever la couche de gelée et de la membrane vitelline de chaque embryon en utilisant deux paires de pinces stériles N ° 5 (11251-30, Outils Fine Science). (Voir les figures 3A et 3B). </li><li> Laver les embryons nus en les faisant passer, un à la fois, à travers les deux autres plats de solution saline à 10% et finalement dans le récipient métallique contenant du FMC. Utiliser une nouvelle pipette stérile pour chaque transfert et minimiser le volume de solution transféré de plat à plat. </li><li> À son tour, chaque embryon tenir doucement mais fermement avec une pince et, en utilisant l&#39;outil de microdissection façonné à l&#39;étape 1.5, retirer le tube neural et myotomes associés qui sont situés à l&#39;aspect le plus dorsale de l&#39;animal. Faire en faisant trois tranches, une à chaque extrémité de l&#39;emplacement du tube neural et un tiers seulement ventrale de celle-ci (figure 4A). Déplacez chaque tube neural disséqué / myotome à une partie propre de la vaisselle hors de la Granul&#39;eau jaunees et d&#39;autres débris (figure 4B). L&#39;axe dorsal-ventral, et les emplacements du tube neural et myotomes sont indiqués sur la figure 4. </li><li> Après une quinzaine de minutes dans cette solution pince utilisation (CMF) pour soulever la peau pigmentée libre du tissu disséqué et jeter. Après un temps supplémentaire 30-60 min, les cellules vont former un &quot;tas de sable&quot;, comme ils se dissocient les uns des autres (figure 4C). </li></ol> 3. Préparation de nerf-muscle co-cultures <ol><li> Décongeler un tube de 10 ml de milieu de culture et ajouter aseptiquement 70 pi SA et 35 ng / ml BDNF (Sigma B3795). </li><li> Étiquette et remplissez stériles boîtes de 35 mm (culture FD35-100 World Precision Instruments) environ à mi-chemin avec un milieu de culture L-15 (solution (e)), un pour chaque embryon disséqués. </li><li> Fabriquer une pipette de placage en saisissant chaque extrémité d&#39;une pipette Pasteur en verre tout en maintenant la partie conique à feu. Tirer les bouts dehors à environ 10 cm et puis se détachent de l&#39;extrémité pour donner une pointe d&#39;environ 0,2 mm. </li><li> Utiliser la pipette placage pour aspirer le &quot;tas de sable&quot; d&#39;un embryon en minimisant la quantité de solution établi. Expulser les cellules sur le fond d&#39;une boîte de culture. Plaque de cellules sur plusieurs lignes. Observez plaqué des cellules indifférenciées (figure 5A et 5B). </li><li> Laisser les boîtes de cellules intactes plaqués pendant au moins quinze minutes pour laisser le temps aux cellules de se fixer l&#39;assiette. </li></ol> 4. Patch-clamp nerf-muscle Synapses <ol><li> Après 12-24 h de culture, les cellules plaquées prendre différentes caractéristiques morphologiques: les cellules musculaires deviennent fusiformes et neurones spinaux étendre les processus longs (figure 6). Fonctionnelle contact synaptique entre les varicosités neurites et les cellules musculaires peuvent être confirmés par paires simultanées des enregistrements électrophysiologiques. &quot;M&quot;, &quot;S&quot; et &quot;V&quot; se réfèrent respectivement à la cellule musculaire, neuronalesoma et varicosités présynaptique. </li><li> Préparer deux électrodes de patch pour l&#39;enregistrement: l&#39;un pour le varicosités présynaptique et l&#39;autre pour la cellule musculaire. </li><li> Pour l&#39;électrode présynaptique, préparer une solution contenant de l&#39;amphotéricine comme suit: Ajouter 100 ul de DMSO à un tube de 1,5 ml contenant 5 mg d&#39;amphotéricine B (Sigma A4888). Vortex cette solution pendant 10 sec. Ensuite, ajouter 10 ul de cette solution dans un tube à centrifuger second contient 625 K +-ul interne solution pour l&#39;amphotéricine B (solution de (h)). Vortex comme ci-dessus. </li><li> Remplir l&#39;électrode de pré-synaptique avec l&#39;amphotéricine contenant K +-interne solution préparée à l&#39;étape 4,3 et l&#39;électrode de post-synaptique avec K +-interne solution (solution (g)). </li><li> Remplacez le support dans la boîte de culture avec NFR et le transférer à un microscope inversé équipé d&#39;une optique à contraste de phase. </li><li> Positionnez les deux électrodes juste au-dessus de leurs cibles respectives. Obtenir la collaboration de cellules entièresnfiguration avec l&#39;électrode de la cellule musculaire avant la configuration de patch perforé avec l&#39;électrode de varicosités. </li><li> Pour confirmer le fonctionnement de la synapse, dépolariser la varice avec un amplificateur de patch-clamp (par exemple Axopatch 200B, Molecular Devices) sous le contrôle du logiciel (par exemple pCLAMP 9, Molecular Devices) et d&#39;observer les courants simultanés présynaptiques et postsynaptiques. La figure 7 montre les courants observés en réponse à la dépolarisation des mesures de tension donnés à la varicosités présynaptique par incréments de 10 mV à -30 mV à +40 mV. Les courants entrants vus dans la cellule présynaptique sont portés par Na + et Ca 2 + et les courants sortants par K +. Courants enregistrés dans la cellule postsynaptique sont des réponses à des neurotransmetteurs libérés de la varice et sont portées principalement par des ions Na + à travers les canaux récepteurs de l&#39;acétylcholine nicotinique. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les principales étapes de la co-culture réussie des motoneurones et les cellules musculaires sont l&#39;utilisation d&#39;embryons mis en scène de façon appropriée produits de l&#39;élevage de grenouilles Xenopus induite, et la dissection minutieuse aseptique des neurones spinaux et les myoblastes non différenciés. Les œufs fécondés devrait être laissé au repos jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent environ 10 ou scène afin de les déplacer plus vite souvent freine leur développement. Embryons sains sont identifiés par un aspect lisse et une brune et blanche tachetée de coloration. Etape 22-24 embryons sont les plus utiles, car c&#39;est le point au cours du développement, juste après la fermeture du tube neural et avant les myocytes se sont différenciés de façon significative. En outre, les cellules provenant d&#39;embryons plus âgés ne parviennent pas à dissocier ainsi au FCM. Des précautions doivent être prises lors du retrait de la membrane vitelline car elle adhère fortement à l&#39;embryon. La membrane doit être déchiré l&#39;aide de pinces pointues pour que l&#39;embryon se dégage intacte. Une autre importante precaution est de bien placer les cellules sur le fond de la boîte de culture (plutôt que de les laisser s&#39;y installer). Cette méthode est préférable car cela augmente la probabilité que les cellules adhèrent à la boîte de culture. Neurotransmission fonctionnelle entre le nerf et le muscle peut être déterminée avec enregistrement juste postsynaptique et, souvent, peut être déterminée par l&#39;observation de la contraction musculaire spontanée après innervation. Cellules musculaires innervées non pas se contracter dans la culture. D&#39;enregistrement postsynaptique seule est utile pour enregistrer des plateaux vertébraux courants miniatures ou potentiels, mais des mesures de libération évoquée nécessite une stimulation présynaptique, et la corrélation des courants pré-et post-synaptique exige le double de patch-clamp. En plus de la méthode d&#39;enregistrement appariés correctif décrit ici, cette préparation offre la possibilité d&#39;introduire une pipette troisième au soma neuronal 5 Ce permet la génération d&#39;un potentiel d&#39;action that peut se propager à la varicosités présynaptique et conduire à la libération de neurotransmetteurs. En outre, les agents putatifs qui sont censés servir de médiateur ou de moduler la transmission synaptique peut être introduit de chaque côté de la synapse: via la pipette cellule musculaire ou par diffusion à partir d&#39;une pipette à la troisième place soma.

<table border="1"><tbody><tr><td> Équipement / Fournitures </td><td> Vendeur </td><td> Catalogue / Numéro de modèle </td><td></td></tr><tr><td> Insulin-transferrine-Sélénium </td><td> Sigma </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> La gonadotrophine chorionique humaine </td><td> Sigma </td><td> CG-10 </td><td></td></tr><tr><td> Osmomètre Pression de vapeur </td><td> Wescor </td><td> 5100C </td><td></td></tr><tr><td> Pins minuties </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-10 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;amphotéricine B </td><td> Sigma </td><td> A4888 </td><td></td></tr><tr><td> Forceps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11251-30 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Nom de solution </td><td> Recette </td></tr><tr><td> (A) NFR (Ringer de grenouille normale (en mM) </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, 1,8 CaCl2, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (B) une solution saline à 10% </td><td> 10 ml NFR 90 ml H 2 O déminéralisée </td></tr><tr><td> (C) CMF (Ca 2 + / Mg 2 + sans solution) </td><td> 125 NaCl, 2 KCl, 1,2 EDTA, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (E) Support L-15 de la culture </td><td> 50 ml L-15 (Sigma L1518 médias) + 50 ml NFR. </td></tr><tr><td> (G) K +-solution interne (en mM) </td><td> 116 KCl, 1 de NaCl, 1 MgCl2, 10 EGTA, HEPES 5, pH 7,3 </td></tr><tr><td> (H) K +-solution interne de l&#39;amphotéricine B (en mM) </td><td> 52 K 2 SO 4, KCl 38, 1 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table> Table 1.

simultaneous pre- and post-synaptic electrophysiological recording from xenopus nerve-muscle co-cultures

Beaucoup d&#39;informations sur le couplage des courants ioniques présynaptiques avec la libération de neurotransmetteur a été obtenue à partir de préparations d&#39;invertébrés, notamment le calmar géant synapse 1. Toutefois, à l&#39;exception de la préparation décrite ici, il existe peu de préparations vertébrés dans lequel il est possible d&#39;effectuer des mesures simultanées de la libération des neurotransmetteurs et des courants ioniques présynaptiques. Embryonnaires de Xenopus motoneurones et les cellules musculaires peuvent être cultivées ensemble dans un milieu de culture simple à la température ambiante, ils vont former des synapses fonctionnelles dans les 12 à 24 heures, et peut être utilisée pour étudier les nerfs et le développement des cellules musculaires et les interactions synaptiques pendant plusieurs jours (jusqu&#39;à ce que prolifération se produit). Quelques avantages de ces co-cultures sur les préparatifs autres vertébrés comprennent la simplicité de préparation, la capacité de maintenir les cultures et le travail à la température ambiante, et l&#39;accessibilité aisée des synapses formée 2-4. La préparation a été largement utilisé pour étudier les propriétés biophysiques des canaux ioniques présynaptiques et la régulation de 5-8 libération du transmetteur. En outre, la préparation s&#39;est prêté à d&#39;autres usages, y compris l&#39;étude de la croissance des neurites et la synaptogenèse 9-12, les mécanismes moléculaires de la libération des neurotransmetteurs 13-15, le rôle de messagers diffusibles dans neuromodulation 16,17, et in vitro plasticité synaptique 18 - 19.

La figure 4B montre la vue dorsale d&#39;un cordon médullaire isolée / myotome immédiatement après son retrait à partir d&#39;un embryon de Xenopus étape 22. Figure 4C montre que, après l&#39;enlèvement de la peau et la solution d&#39;incubation de Ca 2 +-Mg 2 + sans solution (CMF, ( c)), les cellules se dissocient en un &quot;tas de sable&quot; et sont prêts pour le placage. Immédiatement après l&#39;étalement dans les cellules du milieu de culture présentent peu de variabilité morphologique (figure 5B), mais prendre des formes distinctes après 24 heures de culture. Les cellules musculaires deviennent fusiformes alors que les neurones restent sphériques tout en s&#39;étendant neurites qui varicosites élaborés au niveau des synapses avec les cellules musculaires (figure 6). L&#39;enregistrement simultané de correctif associé de la varice présynaptique et postsynaptique des cellules musculaires (figure 7) révèle les courants présynaptiques entrants et sortants associés à la libération de neurotransmetteurs et la resultant courants postsynaptiques excitateurs. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1:.. Paire d&#39;élevage de grenouilles dans un seau d&#39;accouplement au sommet de l&#39;écran B: Frogs in amplexus avec des œufs fécondés. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2:. B &quot;convenable&quot; embryon étape 22:. &quot;Impropre&quot; stade 28 embryonnaire. La barre d&#39;échelle représente 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3:. Stage 22 embryons avant de les enlever de vitelline membrane et la couche gelée. La flèche indique le bord extérieur de la couche gelée. La membrane vitelline adhère intimement à la embrans et est pratiquement invisible B:. embryon nu. La barre d&#39;échelle représente 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4: Stage 22 embryons par une ligne en pointillés indiquant à être disséqué partie B:.. Aiguë isolée partie dorsale de l&#39;embryon; &quot;d&quot; et &quot;v&quot; se réfèrent aux aspects dorsale et ventrale de l&#39;embryon, tandis que &quot;m&quot; et «n» indiquent les emplacements approximatifs des mytomes et tube neural C:. &quot;tas de sable&quot; de cellules après 60 min au FCM. La barre d&#39;échelle représente 1 mm pour A, et 0,5 mm pour B et C. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig5.jpg" alt="Figure 5"/> A la figure 5:. 5x vue puissance de cellules en culture immédiatement après l&#39;étalement. B: la culture même à 40x. Échellebarre représente 40 pm pour A et pour B. 5 pm <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. Jonction neuromusculaire en culture avec identification de neurones soma (S), varicosités présynaptique (V), et la cellule postsynaptique du muscle (M). Barre d&#39;échelle: 5 um. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7.jpg" alt="Figure 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7highres.jpg"/> Figure 7. Présynaptiques (en haut) et post-synaptique (en bas) courants observés en réponse à la demande de 10 mV de tension progressive étapes présentées à la varicosités présynaptique de -30 mV à +40 mV. Mesures de tension sont indiquées à côté de quelques-unes des traces présynaptiques. Le potentiel de maintien pour les deux cellules était de -70 mV.

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Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Cette vidéo montre les procédures utilisées pour cultiver des cultures primaires d&#39;embryon de<em&gt; Xenopus</emNerf&gt; et les cellules musculaires et l&#39;utilité de cette préparation pour faire simultanées pré-et post-synaptique des enregistrements de patch-clamp.

Simultanée pré-et post-synaptique enregistrement électrophysiologique de<em&gt; Xenopus</em&gt; Nerf-muscle co-cultures

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

simultaneous-pre-post-synaptic-electrophysiological-recording-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

10.8K vues.  David Geffen School of Medicine at UCLA. Cette vidéo montre les procédures utilisées pour cultiver des cultures primaires d'embryon de Xenopus et les cellules musculaires et l'utilité de cette préparation pour faire simultanées pré-et post-synaptique des enregistrements de patch-clamp.

Vidéo: Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

Dérivation des cultures enrichies en oligodendrocytes et Oligodendrocyte / Neuron myélinisantes co-cultures de post-natal tissus murins

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Recherche

Neurosciences

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Enregistrement simultané des signaux calciques de neurones identifiés et le comportement alimentaire des Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Des cultures d&#39;explants neuraux de<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Prosencéphale enregistrement électrophysiologique des larves dans le poisson-zèbre

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Enregistrement électrophysiologique dans le cerveau d&#39;Intact poisson zèbre adulte

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

A Method for Systematic Electrochemical and Electrophysiological Evaluation of Neural Recording Electrodes

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant characteristics.&#160;This precludes a rational selection of a particular implant as optimal for a particular application and the development of new materials based on the most critical performance parameters.&#160;This article develops a protocol for in vitro and in vivo testing of neural recording electrodes.&#160;Recommended parameters for electrochemical and electrophysiological testing are documented with the key steps and potential issues discussed.&#160;This method eliminates or reduces the impact of many systematic errors present in simpler in vivo testing paradigms, especially variations in electrode/neuron distance and between animal models.&#160;The result is a strong correlation between the critical in vitro and in vivo responses, such as impedance and signal-to-noise ratio.&#160;This protocol can easily be adapted to test other electrode materials and designs.&#160;The in vitro techniques can be expanded to any other nondestructive method to determine further important performance indicators.&#160;The principles used for the surgical approach in the auditory pathway can also be modified to other neural regions or tissue.

Different electrode coatings affect neural recording performance through changes to electrochemical, chemical and mechanical properties. Comparison of electrodes in vitro is relatively simple, however comparison of in vivo response is typically complicated by variations in electrode/neuron distance and between animals. This article provides a robust method to compare neural recording electrodes.

Une méthode pour électrochimique systématique et l&#39;évaluation électrophysiologique des neurones électrodes d&#39;enregistrement

New materials and designs for neural implants are typically tested separately, with a demonstration of performance but without reference to other implant ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

Enregistrement électrophysiologique De<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Goût Sensilles

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Simultanée électrophysiologique Enregistrement et micro-injections d&#39;agents inhibiteurs dans le cerveau des rongeurs

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the electrical responses of the retina to light stimulation, while the VEP measures the corresponding functional integrity of the visual pathways from the retina to the primary visual cortex following the same light event. The ERG waveform can be broken down into components that reflect responses from different retinal neuronal and glial cell classes. The early components of the VEP waveform represent the integrity of the optic nerve and higher cortical centers. These recordings can be conducted in isolation or together, depending on the application. The methodology described in this paper allows simultaneous assessment of retinal and cortical visual evoked electrophysiology from both eyes and both hemispheres. This is a useful way to more comprehensively assess retinal function and the upstream effects that changes in retinal function can have on visual evoked cortical function.

This protocol describes simultaneous measurement of electroretinogram and visual evoked potentials in anesthetized rats.

Enregistrement simultané de Électrorétinographie et potentiels évoqués visuels chez des rats anesthésiés

The electroretinogram (ERG) and visual evoked potential (VEP) are commonly used to assess the integrity of the visual pathway. The ERG measures the ...