Les modèles xénogreffes et les lignées cellulaires primaires dérivés du patient font désormais partie intégrante du développement de médicaments et de l’initiation et de la progression de la recherche en biologie tumorale. Les modèles Xenograft dérivés du patient préservent l’aspect histologique des cellules cancéreuses, conservent l’hétérogénéité intratumorale et reflètent mieux les composants humains pertinents du microenvironnement tumoral. Ses modèles sont pour des représentations plus précises du cancer humain que les lignées cellulaires cancéreuses traditionnelles et ont le potentiel d’améliorer l’évaluation préclinique de nouvelles thérapies anticancéreuses.
En outre, ces modèles peuvent être utiles en comparant les caractéristiques moléculaires ou les signatures tumorales entre différents sous-groupes de patients atteints de cancer. Les souris NSG sont recommandées comme modèle immunodéficient de souris. En raison de l’immunodéficience grave des souris, la stérilité doit être maintenue dans toutes les expériences.
Dans des conditions stériles, utilisez des forceps et des ciseaux pour disséquer soigneusement les tissus tumoraux et les couper en plusieurs petits morceaux. Après anesthésier la souris, utilisez des ciseaux stériles pour faire une incision d’un centimètre sur les deux flancs dorsal. Utilisez des forceps stériles pour perturber le tissu sous-cutané.
Ensuite, couper un morceau du tissu tumoral, et le placer dans le site profond. Fermer la zone de l’implant par suture sous-cutanée avec des aiguilles de suture chirurgicales. Stériliser la plaie avec de l’iode.
Après cela, placez doucement les souris dans une cage vide tout en maintenant la récumbence sternale. Portez une attention particulière aux souris qui devraient se réveiller et commencer à marcher après environ trois à quatre minutes. Placez les souris qui ont subi une intervention chirurgicale dans une nouvelle cage séparées de celles qui ne sont pas soumises à la chirurgie.
Évaluez la taille de tumeur par palpation du site d’implantation et mesurez-les avec un étrier de Vernier deux fois par semaine. Après avoir euthanasié les souris, utilisez des forceps stériles et des ciseaux pour isoler lentement la tumeur des souris. Lavez les tissus tumoraux dans DPBS dans un plat de 10 centimètres.
Vous forceps et ciseaux pour disséquer et enlever les zones nécrotiques, les tissus adipeux, les caillots sanguins et les tissus conjonctifs. Ensuite, utilisez un moule pour couper les tissus tumoraux à une épaisseur maximale d’un millimètre. Laver les tranches tumorales avec du DPBS dans un plat de 10 centimètres.
Pour commencer le processus de vitrification, utilisez des forceps pour transférer les tranches dans le tube V1 et incuber à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes. Rouler et inverser brièvement le tube et incuber à quatre degrés Celsius pendant encore quatre minutes. Ensuite, versez la solution V1 et les tranches dans un plat de 10 centimètres et utilisez des forceps pour transférer les tranches dans le tube V2. Incuber à quatre degrés Celsius pendant quatre minutes.
Rouler et inverser brièvement le tube et l’incuber à quatre degrés Celsius pendant encore quatre minutes. Après cela, versez la solution V2 et les tranches dans un plat de 10 centimètres. Transférer les tranches dans le tube V3 et incuber à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Rouler et inverser brièvement le tube et incuber à quatre degrés Celsius pendant encore cinq minutes. Assurez-vous que toutes les tranches coulent au fond du tube. Si plusieurs tranches restent flottantes, roulez et inversez brièvement le tube et incubez à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que toutes les tranches coulent complètement.
Verser ensuite la solution V3 et les couper en tranches dans un plat de 10 centimètres. Coupez les porte-tissus à la bonne longueur et placez-les sur de la gaze stérile. Transférer les tranches sur les supports.
Envelopper les supports de gaze. À l’aide de forceps, placer les supports dans de l’azote liquide et les laisser incuber pendant cinq minutes. Après cela, étiquetez les flacons cryogéniques avec l’information tissulaire.
Transférer les supports avec des tranches de tissu dans les flacons, qui seront stockés dans de l’azote liquide. Tout d’abord, réécectez des échantillons gastriques de cancer à partir de spécimens réséqués ou de tissus PDX récoltés. Placez les tissus sur la glace et transférez-les dans un plat de culture stérile de 10 centimètres.
Utilisez des forceps et des ciseaux pour enlever les zones nécrotiques, les tissus adipeux, les caillots sanguins et les tissus conjonctifs. Lavez les tissus tumoraux une fois avec du DPBS contenant de la pénicilline et de la streptomiycine dans un plat de 10 centimètres. Ensuite, coupez la tumeur en morceaux sur le couvercle du plat.
L’épaisseur maximale de chaque pièce doit être d’un millimètre. Transférer les morceaux dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres contenant sept millilitres d’une solution de collagène et de trypsine de type 1. Vortex le mélange brièvement.
Incuber dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 30 à 40 minutes, en s’assurant de vortex le mélange toutes les cinq minutes. Après cela, ajouter un volume égal de RPMI-1640 moyen complété avec 10%FBS et vortex le mélange à fond. Transférer ce mélange dans un nouveau tube centrifugeuse de 50 millilitres par filtration lente à travers un filtre de 40 microlitres.
Centrifuger les filtrates à une vitesse comprise entre 113 et 163 fois g pendant cinq à sept minutes à température ambiante. Retirez soigneusement ce supernatant. Laver la pastille avec cinq millilitres de PBS et retirer soigneusement le supernatant.
Si la pastille est rouge, elle contient des érythrocytes. Resuspendez doucement la pastille avec 500 microlitres de tampon de lyse de globule rouge et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Ajouter ensuite cinq millilitres de PBS.
Centrifugeuse à une vitesse comprise entre 113 et 163 fois g pendant cinq à sept minutes à température ambiante. Retirer délicatement le supernatant et resuspendre la pastille avec le milieu de culture et transférer le mélange dans un plat stérile de 10 centimètres. Incuber la culture à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone, en s’assurant de remplacer le milieu par un milieu contenant du sérum tous les deux à trois jours.
Dans cette étude, des modèles gastriques de PDX de cancer et des lignes primaires de cellules sont établis. Les tumeurs de première génération se développent plus lentement que celles des générations suivantes, prenant trois semaines ou plus pour atteindre la taille appropriée. Le taux de réussite de la formation de tumeurs sous-cutanées de première génération est de plus de 80%L’identité des cellules cancéreuses des modèles PDX est confirmée à partir des modèles PDX par la coloration H&E.
Le taux de succès de la formation de tumeur du tissu cryopreserved de tumeur est vu pour être approximativement 95%Cellules de tumeur peut être facilement identifiée par des différences dans la morphologie. Les cellules primaires sont authentifiées indépendamment par deux pathologistes au microscope. Pour plus de confirmation, la coloration H&E est utilisée pour observer la morphologie des cellules cancéreuses après fixation.
Le taux d’isolement réussi des lignées cellulaires primaires est d’environ 40 %Ces modèles se sont montrés prédictifs des résultats cliniques et sont utilisés pour l’évaluation préclinique des médicaments par une identification par marqueur, des études biologiques et des stratégies de médecine personnalisée.
