Cette méthode est significative parce que les modèles organoïdes patients-dérivés sont un outil puissant et rapide pour étudier le cancer pancréatique car ils reflètent l’hétérogénéité génétique et phénotypique de cette maladie. Le principal avantage de cette technique est que les organoïdes peuvent être isolés avec un taux de réussite élevé à partir d’une quantité limitée de cancer et ils peuvent être étendus rapidement in vitro pour l’analyse en aval. L’étude de la réponse des organoïdes aux médicaments cytotoxiques peut nous aider à comprendre pourquoi les tumeurs deviennent résistantes à la thérapie et à définir des stratégies de traitement plus efficaces.
Pour commencer cette procédure, récupérez la plaque préparée de 12 puits de l’incubateur. À l’intérieur d’un haltérophile stérile, soulevez doucement le dôme d’extrait de membrane du sous-sol de sorte qu’il flotte dans le média complet tout en s’assurant d’éviter de racler le fond du puits. À l’aide d’une pipette P1000, transférez soigneusement le dôme BME et le média dans un tube conique de 15 millilitres.
Répétez cette étape pour chaque puits contenant des organoïdes. Lavez doucement chaque puits récolté avec un millilitre de fond basal froid et transférez ce lavage dans le tube contenant les organoïdes. Bien mélanger la solution et les organoïdes avec une pipette P1000 et faire tourner à 200 fois g pendant cinq minutes.
Une couche de BME contenant des organoïdes en suspension et une pastille organoïde apparaîtra au fond du tube. Retirez soigneusement le supernatant en vous assurant d’éviter toute perte de la couche de BME et d’organoïde. Placez le tube sur la glace.
Ajouter 10 millilitres de solution de récupération des cellules glacées au tube et bien mélanger par inversion. Incuber sur la glace pendant 30 minutes tout en mélangeant toutes les trois minutes par inversion. Après cela, centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq minutes.
La pastille organoïde doit être apparente tandis que la couche de BME devrait avoir disparu. Si la couche de BME est diminuée en taille mais toujours visible, incuber pendant 30 minutes supplémentaires à quatre degrés Celsius et répéter la centrifugation. Une fois que le BME a été dépolymérisé, retirez la solution de récupération cellulaire tout en laissant derrière lui la pastille organoïde.
Laver les organoïdes avec 10 millilitres de médias basiques en mélangeant avec l’inversion. Centrifugeuse à 200 fois g pendant cinq minutes, retirer le supernatant, et placer le tube avec la pastille organoïde sur la glace pendant au moins cinq minutes. En option, si une préparation à cellule unique est souhaitée, ajouter trois millilitres de trypsine complétés par 30 microlitres de solution DNAse I aux organoïdes.
Incuber cette réaction enzymatique à 37 degrés Celsius avec une inversion douce mélange toutes les deux minutes pendant un jusqu’à 10 minutes. Utilisez un microscope Brightfield pour surveiller et confirmer que la dissociation d’une seule cellule est réussie. Pour arrêter la réaction enzymatique, ajouter 10 millilitres de médias basaux glacés et faire tourner à 200 fois g pendant cinq minutes.
Retirez ensuite le surnatant. Laver les cellules avec 10 millilitres de fond basal en mélangeant avec une inversion douce. Centrifugeuse à nouveau à 200 fois g pendant cinq minutes.
Retirez le supernatant et répétez ce processus de lavage et de centrifugeuse une fois de plus. Placez le tube avec la pastille cellulaire sur la glace pendant au moins cinq minutes. Après cela, ajouter du BME glacé à la pastille cellulaire et utiliser une pipette P200 pour mélanger la solution doucement jusqu’à ce qu’elle soit homogène.
Ensuite, placez la pointe de la pipette près du fond du tube et pipette de haut en bas au moins cinq à dix fois pour briser mécaniquement les organoïdes. Utilisez une pipette P200 pour repérer un dôme de 100 microlitres au centre d’un puits d’une plaque préchauffée de 12 puits. Répétez l’année jusqu’à ce que toute la solution BME soit distribuée.
Ensuite, transférez soigneusement la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius pour permettre au gel BME de se solidifier. Après 10 minutes, récupérer la plaque et ajouter un millilitre de supports complets organoïdes préchauffés à chaque puits. Les cultures organoïdes sont généralement dépassées sur sept à dix jours selon la densité et la prolifération de la culture.
Si nécessaire, rechargez les cultures avec 200 microlitres de supports complets organoïdes préchauffés tous les cinq jours pour compenser l’épuisement et l’évaporation des facteurs de croissance. Après avoir isolé des cellules simples des organoïdes, résuspendez les cellules simples dans un millilitre de médias complets organoïdes humains. Ensuite, utilisez un compteur cellulaire automatisé pour compter les cellules en s’assurant d’enregistrer la viabilité de la cellule.
Calculer le nombre total de cellules et de cellules viables présentes dans la suspension d’un millilitre. Ensuite, retirez le volume équivalent à 400 000 cellules et transférez-le dans un nouveau tube. Ajoutez des supports complets organoïdes à ce tube pour porter le volume jusqu’à 7,2 millilitres.
Pour les tests thérapeutiques, préparer les cellules au placage en mélangeant 800 microlitres de BME avec 7,2 millilitres de supports complets organoïdes contenant les cellules sur la glace. Transférer le mélange dans un réservoir maintenu sur la glace et utiliser une pipette à 12 canaux pour plaquer 20 microlitres de ce mélange dans chaque puits d’une plaque de puits de 384 puits, ce qui entraîne environ 1000 cellules plaquées par puits. Puis faites tourner la plaque à 100 fois g pendant une minute dans un seau à balançoire et placez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius.
Après 24 heures, utilisez un microscope Brightfield pour vérifier la présence d’organoïdes. Dans cette étude, les organoïdes pdac dérivés du patient sont isolés, élargis et caractérisés. Pour illustrer les défis associés à l’isolement des organoïdes du PDAC, une culture organoïde représentative dérivée du patient est établie à partir d’un petit échantillon hypocellulaire de tumeur.
Les organoïdes sont autorisés à s’agrandir en l’espace de deux semaines et sont adoptés selon le protocole pour établir une culture plus robuste. Les cellules individuelles d’un organoïde PDAC représentatif établi et à croissance rapide sont alors prêtes à démontrer les résultats du protocole pharmacotyping. 1000 cellules viables sont plaquées dans chaque puits et autorisées à récupérer sur une période de 24 heures avant que les agents chimiothérapeutiques cytotoxiques ne soient dosés.
Un test de dose de 9,0 est effectué en triplicate à partir d’une faible dose de 100 picomolaire et se terminant par une dose élevée de deux micromolaires. Après un traitement de cinq jours, des photos représentatives sont prises pour les puits traités avec le véhicule et avec la dose élevée de chaque agent chimiothérapeutique. Immédiatement après la prise des photos, la viabilité cellulaire est évaluée à l’aide d’un réaccente de viabilité cellulaire luminescente et tracée à l’aide d’un logiciel graphique.
Les organoïdes d’origine patiente peuvent avoir des morphologies hétérogènes. Par conséquent, il est important d’optimiser les dissociations enzymatiques pour chaque culture. L’analyse en aval des modèles dérivés du patient implique habituellement le séquençage de prochaine génération de l’ADN et de l’ARN.
Si possible, valider les caractéristiques moléculaires des modèles à l’aide d’échantillons de tissus primaires. Les cultures organoïdes individualisées ouvrent la possibilité d’approches de médecine personnalisée pour les patients atteints de cancer du pancréas. N’oubliez pas que les produits chimiques dangereux tels que le phénol-chloroforme et les agents chimiothérapeutiques doivent être manipulés avec l’EPI approprié et l’équipement de sécurité.
