Nos recherches portent principalement sur les mécanismes réceptifs au froid des juvéniles du troisième stade de dispersion du nématode des pins, en s’intéressant plus particulièrement à la façon dont le nématode des pins résiste à un stress à basse température à environ moins 20. Le défi expérimental actuel est le temps de déshydratation, qui est essentiel pour déterminer le taux de survie des juvéniles de dispersion au troisième stade de Bursaphelenchus xylophilus. Nous vous conseillons de dire que plus le temps est long, mieux c’est l’accent.
Nous avons établi que l’entrée des juvéniles de dispersion du troisième stade de Bursaphelenchus xylophilus dans la cryptobiose leur permet de résister à des environnements à très basse température, mettant en évidence un mécanisme de survie clé dans des conditions difficiles. Notre protocole comble les lacunes de la recherche en induisant la cryptobiose chez les nématodes du bois de pin et en les faisant revivre avec succès sur le plan architectural. Il permet des études contrôlées de leurs mécanismes de survie et d’autres applications.
Notre protocole est simple et fiable pour un support technique très robuste pour résister aux mécanismes de résistance au stress du nématode du bois du pin, ce qui le rend plus accessible et efficace par rapport à d’autres techniques. Commencez par couper les bûches rondes de Pinus massoniana collectées en tranches de 0,5 à un centimètre d’épaisseur à l’aide d’une scie. Coupez les tranches en petites lanières de deux à trois centimètres de long.
Placez les petites bandes de bois dans des sacs scellés et stockez-les dans un laboratoire pour une utilisation ultérieure. Fixez un tube en caoutchouc à l’extrémité étroite d’un entonnoir en verre à long col d’un diamètre approximatif de 15 centimètres. Fixez le tube en caoutchouc avec un robinet et placez l’entonnoir assemblé sur un support d’entonnoir.
Enveloppez complètement les petites bandes de bois dans une seule couche de papier de soie. Placez les bandes de bois enveloppées dans l’entonnoir et ajoutez de l’eau distillée jusqu’à ce que toutes les bandes de bois soient immergées, puis relâchez lentement le robinet au fond de l’entonnoir et laissez 2000 à 5 000 microlitres du mélange s’écouler dans une boîte de Pétri de cinq centimètres de diamètre pour un examen microscopique et une identification morphologique. Observez le mélange pour identifier J3 Bursaphelenchus xylophilus en notant des caractéristiques telles que des stylets, des bulbes œsophagiens médians, des gouttelettes lipidiques et des formes de queue en forme de doigt.
À l’aide d’une pipette de 10 microlitres, aspirez 10 microlitres de liquide avec un nématode à chaque fois pour transférer individuellement J3 Bursaphelenchus xylophilus sur une lame. Enfin, stérilisez les bandes de bois restantes et les matériaux en bois infectés après avoir extrait J3 Bursaphelenchus xylophilus pour éviter toute contamination supplémentaire. Pour commencer, extrayez des échantillons de J3 Bursaphelenchus xylophilus de Pinus massoniana, puis préparez une solution aqueuse de chlorure de potassium à 8 % pour la régulation osmotique.
À l’aide d’une pipette, ajoutez 10 microlitres de la solution aqueuse de chlorure de potassium à 8 % sur la lame contenant le mélange de J3 Bursaphelenchus xylophilus. Placez la lame sur la platine du microscope et laissez l’eau s’évaporer naturellement. Observez au microscope le processus de déshydratation de J3 Bursaphelenchus xylophilus.
Surveillez les signes tels que l’enroulement et l’agrégation du corps. Lorsque l’eau s’évapore complètement et que les cristaux de chlorure de potassium précipitent, observez les nématodes arrêter leur mouvement et entrer dans la cryptobiose. Placez le cryptobiotique J3 Bursaphelenchus xylophilus dans un environnement à température constante de moins 20 degrés Celsius pendant 24 heures.
Après 24 heures, utilisez une pipette pour ajouter environ 300 microlitres d’eau distillée autour des juvéniles qui ont subi un traitement à basse température. Observez le processus de réhydratation de J3 Bursaphelenchus xylophilus au microscope. Surveillez les signes tels que l’étirement du corps et la reprise du mouvement.
