Nous tenons à remercier Thomas Lecuit (la ligne de GFP de SQH-utrophine), Bloomington Stock Center, et le développement des études Hybridoma Banque des réactifs. Nous remercions en outre tous les membres de la Tootle Lab pour des discussions utiles et des critiques du manuscrit. Le financement de la National Science Foundation MCB-1158527, et des fonds de démarrage de l&#39;anatomie et de département de biologie cellulaire de l&#39;Université de l&#39;Iowa ont soutenu ce travail. National Institutes of Health des subventions de formation pré-doctorale en sciences pharmacologiques T32GM067795 soutenu SJA. support de stockage de données ont été fournies par l&#39;ICTS, qui est financé par le CSTC soutenue par le National Center for Research Resources et le Centre national pour l&#39;avancement des sciences translationnelle, National Institutes of Health, par Grant UL1RR024979.

Une. Préparation Drosophila avant l&#39;étape d&#39;isolement <ol><li> Faire de la pâte de levure humide en combinant 50 g de levure sèche active avec 90 ml d&#39;eau distillée. Mélanger avec une spatule pour mélanger. Laissez reposer le mélange pendant 30 min ~ avant d&#39;évaluer la cohérence. La consistance doit être juste assez épaisse pour adhérer au côté d&#39;un flacon de volée mais ne fonctionne pas sur le côté. Pour obtenir la consistance désirée, il peut être nécessaire d&#39;ajouter à 10 ml d&#39;eau supplémentaire ou d&#39;une petite quantité de levure sèche. Conserver dans un récipient couvert à 4 ° C. La levure stockée peut être utilisée pour ~ 1-2 semaines. </li><li> Recueillir &lt;24 h vieilles mouches adultes (deux mâles et femelles) des génotypes souhaités et de les mettre dans un flacon avec de la nourriture à la mouche ainsi que la pâte de levure humide étalé sur le côté du flacon. La température à laquelle les mouches sont maintenues variera en fonction de l&#39;expérience. Pour les expériences de routine, les mouches sont maintenus à la température ambiante. Attendu que des expériences dans lesquelles un gène estest surexprimé en utilisant le système UAS/GAL4 15 mai exiger le maintien de vol à 25 ° C ou plus, le cas échéant. </li><li> Fournir les mouches avec un nouveau frottis de pâte de levure par jour pendant 2 jours. NOTE: Comme le développement des follicules est étroitement régulée par l&#39;état nutritionnel de la mouche femelle, il est essentiel de fournir à la volée avec la pâte riche en éléments nutritifs de la levure pendant au moins 36 heures avant la dissection. </li></ol> 2. Isoler la mi et la fin de la drosophile par étapes follicules <ol><li> Autoriser les médias à venir à la température ambiante (~ 30 minutes). Si les follicules organisées vont être utilisés pour essais in vitro de développement, fraîchement préparer IVEM médias (insectes médias de Grace, 10% de sérum fœtal bovin inactivé à la chaleur, et 1x pénicilline / streptomycine). Si les follicules organisées vont être utilisés pour l&#39;ARNm ou l&#39;isolement de protéines utilisent soit des insectes de Grace ou IVEM médias. IMPORTANT: la température des médias est essentiel. Si le support est froid, il va modifierà la fois de l&#39;actine et le cytosquelette de microtubules et de développement de bloc. </li><li> Anesthésier les mouches dans le flacon à la levure par injection de CO 2 gaz et placez 3-5 mouches femelles sur un bloc de mouche sous CO 2. IMPORTANT: Ne laissez pas plus de femmes que peuvent être disséqués dans une période de temps de 10 min sur le pavé de la mouche que l&#39;exposition prolongée au CO 2 peut provoquer la stérilité et la mort. </li><li> Remplir un puits d&#39;une plaque 9 place avec les médias et le placer sur une surface sombre (un morceau de plexiglas noir fonctionne bien). Focaliser le microscope à dissection sur le fond du puits. </li><li> Utilisation # 5 pince Dumont ramasser une seule femelle avec une seule main (ce qui est le mieux fait en utilisant la main dominante). Il est souvent plus facile de ramasser la femelle par les ailes, les jambes ou le thorax de l&#39;abdomen transition. Immerger la femelle dans les médias bien remplis. Ajuster le foyer du microscope selon les besoins. </li><li> En utilisant une deuxième paire de pince dans la main non dominante, saisir la femelle à l&#39;extrémité antérieure de l&#39;abdomende sorte que l&#39;extrémité postérieure est positionné vers la main dominante (Figure 2A). Assurez-vous de garder la volée immergée dans les médias. </li><li> Avec la main dominante, utilisez la pince pour saisir la cuticule à la 2e secteur pigmentée la plus postérieure et déchirer l&#39;écart du reste de l&#39;abdomen (figures 2B-C). </li><li> Utilisation de la pince dans la main dominante, presser doucement l&#39;extrémité antérieure de l&#39;abdomen jusqu&#39;à ce que les ovaires émergent (figures 2D-E). Si nécessaire, placez la pince entre les deux ovaires et les sortir de la carcasse. </li><li> Soit déplacer les ovaires à un nouveau puits avec du milieu frais (figure 2F) ou retirer la carcasse à une serviette Kimwipe ou papier. Ceci est particulièrement important si les follicules sont isolés pour le développement in vitro. </li><li> Répétez l&#39;opération jusqu&#39;à 3-5 paires d&#39;ovaires ont été isolés. REMARQUE: Chaque ovaire est composé de ~ 16 ovarioles ou des chaînes de manière séquentielle maturation des follicules. Chaque ovarioleest contenu dans une gaine de muscle. </li><li> Utilisation étaux de broches et les aiguilles fournies avec eux, tirer doucement à l&#39;ovaire en exécutant les aiguilles entre les ovarioles (figure 2G). Ce sera parfois libérer les follicules individuels. </li><li> Ovarioles individuels et les étapes morphologiques faciles à distinguer de développement des follicules doivent maintenant être visible (figure 2G, taquiné dehors de l&#39;ovaire). Se reporter aux figures 1 et 2H des différences morphologiques qui peuvent être utilisés pour distinguer les différentes étapes. Pour isoler les follicules qui sont dans ovarioles intactes et encore contenus à l&#39;intérieur d&#39;une gaine du muscle, en utilisant une aiguille de couper à travers la ovariole à la partie antérieure du follicule précédente et à la partie postérieure du follicule qui suit immédiatement le follicule d&#39;intérêt. Ceci brisera la gaine du muscle et le follicule d&#39;intérêt distance peut maintenant être coupé à partir des follicules voisins sans l&#39;endommager. </li&gt; <li> Comme les stades individuels sont séparés, déplacer les follicules présentant un intérêt, en utilisant une pipette en verre, d&#39;un nouveau puits avec du milieu frais. Ceci est particulièrement important lors de l&#39;isolation pour le développement des follicules in vitro. NOTE: Il est important de presser la poire de la pipette avant d&#39;entrer dans les médias pour empêcher les bulles d&#39;air de la redistribution des follicules d&#39;intérêt à travers le puits. En outre, si les follicules sont collés à la pipette en verre, la pipette peut être pré-revêtue avec 3% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) par pipetage de la solution de BSA de haut en bas plusieurs fois avec des milieux de rinçage et de dissection. </li><li> Une fois que suffisamment de follicules ont été isolés, procéder à des expériences ultérieures. </li></ol> 3. Développement in vitro de follicules S10B <ol><li> Isoler les follicules S10B en utilisant le protocole d&#39;isolement de l&#39;étape (étape 2) dans des milieux IVEM. Assurez-vous que les follicules sont rapidement éloignés de débris. Comme ces follicules vont continuer à mûrir, il est important que S10Bs sont collectées pendant 30-60 min, puis placé dans le milieu de maturation de choix. REMARQUE: S10B convient de distinguer soigneusement de follicules S10A (figure 1C par rapport à 1B), que les follicules S10A ne mûriront pas dans le milieu de culture IVEM. Dans les deux S10A et S10B follicules, la moitié de la longueur est composée de cellules nourricières et que l&#39;autre moitié est l&#39;ovocyte, mais dans S10B la longueur du follicule est égale à celle des follicules S14. </li><li> En utilisant une pipette en verre, déplacer ~ 30 follicules S10B dans un puits d&#39;une plaque de culture tissulaire à 24 puits. REMARQUE: Assurez-vous de vérifier que tous les follicules en cours de transfert sont S10B et n&#39;ont pas évolué au S11. </li><li> Préparer une pi de milieu de maturation par puits, à savoir les médias IVEM ainsi que réactifs pharmacologiques. </li><li> En utilisant une pipette en verre tiré *, supprimer autant les médias du bien (étape 3.2) que possible, et rapidement ajouter médias de maturation des choix. NOTE: Il est essentiel d&#39;utiliser un pépin de verre tiréette que les follicules mise en scène peut être facilement repris soit avec des pipettes en verre ou des embouts de pipette avec un Pipetman. * Pour pipettes tirés: 1) chauffer la partie mince de long, des pipettes en verre dans la flamme d&#39;un brûleur Bunsen jusqu&#39;à ce que le verre commence à se ramollir; 2) passer immédiatement la pipette de la flamme et tirez horizontalement pour tirer la pipette dans un tube plus fin; 3) casser pour générer une pointe fine. ATTENTION: Utilisez des lunettes de protection comme des fragments de verre peuvent s&#39;envoler. </li><li> Répétez les étapes 3.1 à 3.4 pour autant de puits de l&#39;expérience nécessite. </li><li> Permettent de développer les follicules pour&gt; 10 h et marquer la progression du développement sous un microscope à dissection. REMARQUE: Les expériences sont généralement marqué le lendemain pour laisser suffisamment de temps pour les follicules se développent. S10B est ~ 5 h, S11 est ~ 30 min, S12 est ~ 2 heures, et S13 est ~ 1 h dans la durée à 25 ° C 1 et du développement à la température ambiante prendra légèrement plus. Des expériences similaires à celle décrite pour les follicules peuvent être S10Beffectuée à l&#39;aide follicules S11-S13. </li></ol> 4. Etape isolement pour l&#39;imagerie en direct <ol><li> Isoler les follicules en phase avancée (S10B-14) exprimant le marqueur fluorescent de choix en utilisant le protocole d&#39;isolement de l&#39;étape (étape 2) dans des milieux IVEM, se déplaçant rapidement à une distance de follicules de débris. </li><li> Déplacez follicules d&#39;intérêt dans les nouveaux médias et les transférer à la pipette de verre à un fond de couvre-boîte de Pétri. Prenez soin d&#39;ajouter les médias de sorte qu&#39;il bouillonne dans la zone de fond de la lamelle, mais ne pas faire déborder. </li><li> Pour plus de films time-lapse, il est parfois nécessaire pour maintenir l&#39;humidité dans la boîte de Pétri en ajoutant un roulé Kimwipe, humidifié avec de l&#39;eau, au bord intérieur de la boîte de Pétri. Placer le couvercle sur le dessus. </li><li> L&#39;image sur un microscope inversé. Résolution détaillée, il faudra la microscopie confocale. Il est nécessaire pour équilibrer la fréquence de formation d&#39;image, la force d&#39;éclairement, et la longueur de formation d&#39;image, ce qui devra être mis au point de manière indépendante pour chaque loutil de Abeling et processus de développement. </li></ol> 5. Etape isolement pour l&#39;ARNm Préparation <ol><li> Isoler follicules scène individuels en utilisant le protocole d&#39;isolement de l&#39;étape (étape 2) soit avec des médias de Grace ou IVEM. </li><li> En utilisant une pipette en verre, déplacer les étages individuels d&#39;intérêt dans de nouveaux puits avec des supports, il est possible de collecter à la fois des étages multiples. </li><li> Gardez les temps de collecte sous 1 heure. Déplacer les follicules, en utilisant une pipette en verre, à 1,5 ml des tubes de microcentrifugation. </li><li> Spin brièvement le tube dans un mini-centrifuger pour sédimenter tous les follicules. En utilisant une pipette en verre tiré (voir l&#39;étape 3.4) retirez soigneusement tous les médias. NOTE: Si vous utilisez une micro en taille, centrifuger les follicules à basse vitesse. </li><li> Ajouter 100 pi de Trizol et broyer la main pour ~ 20 secondes en utilisant un pilon en plastique. Isoler à pleine vitesse dans une micro et déplacer Trizol dans un nouveau tube de 1,5 ml en faisant attention à ne pas gêner d granulésebris. Conserver à -80 ° C. </li><li> Répétez les étapes 5.1 à 5.5 jusqu&#39;à ce que suffisamment de follicules ont été obtenus pour l&#39;expérience. En routine, S10B ~ 75, ~ 75 S12, et S14 ~ 100 follicules donner ~ 10 pg d&#39;ARN. </li><li> Décongeler les échantillons sur la glace. Combiner les échantillons, le cas échéant, dans un tube de centrifugeuse et porter le volume Trizol jusqu&#39;à 800 pi. Procéder à l&#39;isolement de l&#39;ARN comme indiqué par le fabricant. IMPORTANT: N&#39;oubliez pas de DNase traiter l&#39;ARN isolé avec de la RNase DNase. </li></ol> 6. Etape isolation pour Western Blot <ol><li> Préchauffer un bloc chauffant à 100 ° C. </li><li> Isoler follicules scène individuels en utilisant le protocole d&#39;isolement de l&#39;étape (étape 2) soit avec des médias de Grace ou IVEM. NOTE: Il est nécessaire de déterminer de façon empirique le nombre d&#39;un follicule étape particulière sont nécessaires pour observer chaque protéine spécifique. Pour les protéines fortement exprimés 1-3 S10B follicules / puits est suffisant pour voir un signal fort sur un western blot. Cependant, il est important de faire uneéchantillon représentatif, en follicules de plusieurs femelles. Ainsi, 15-20 follicules d&#39;un stade particulier sont généralement collectées. </li><li> Déplacer follicules, en utilisant une pipette en verre, d&#39;un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Centrifuger brièvement dans une mini-centrifuger pour sédimenter les follicules (voir l&#39;étape 5.4). Retirez soigneusement tous les médias à l&#39;aide d&#39;une pipette de verre tiré (voir l&#39;étape 3.4) et ajouter 50 ul de PBS 1x et 50 pi de tampon Laemmli 2x. </li><li> Broyer à la main pour ~ 20 secondes avec un pilon en plastique. REMARQUE: pilons en plastique peuvent être réutilisés pour le broyage des échantillons de l&#39;Ouest par lavage et les autoclavage. </li><li> Faire bouillir les échantillons pendant 10 minutes dans le bloc chauffant. </li><li> Réfrigérer brièvement sur la glace et de spin à pleine vitesse pendant 15 secondes dans une microcentrifugeuse. Soit immédiatement chargé sur un gel SDS-PAGE ou conserver à -20 ° C. NOTE: Si les échantillons sont conservés, n&#39;oubliez pas de rebouillir les échantillons avant de les charger sur le gel. </li><li> Effectuer une analyse Western blot selon des protocoles standards. </li></ol>

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Il n&#39;y a rien à divulguer.

Le follicule drosophile est composé de seulement un petit nombre de types de cellules, le rendant idéal pour les analyses moléculaires et morphologiques. En outre, en raison de la structure de l&#39;ovaire, il est relativement facile d&#39;obtenir un grand nombre d&#39;étapes spécifiques du développement des follicules avec un microscope à dissection commune et une formation minimale. Comme chaque étape représente une fenêtre temporelle courte, l&#39;isolement de la scène peut fournir des indications...

Chaque ovaire chez la drosophile est composé de ~ 16 ovarioles, ou des chaînes de maturation séquentielle chambres d&#39;oeuf ou de follicules. Chaque follicule est composé d&#39;un seul ovocyte, cellules nourricières ou soutien dérivés 15 lignée germinale, et ~ 650 cellules somatiques appelées cellules folliculaires (figure 1A). Ovogenèse chez la drosophile est divisé en 14 étapes morphologiquement définies de développement 1. Chaque étape du développement folliculaire est observée plusieurs fois dans une seule volée, ce qui rend relativement facile d&#39;isoler un grand nombre de follicules spécifiques de stade. Les étapes de l&#39;ovogenèse (Etapes 10B-14) à mi-et la fin sont particulièrement bien adaptés pour l&#39;isolement de l&#39;étape (Figure 1). Au stade 10B (S10B), le follicule est complètement allongée (sa longueur est égale à celle d&#39;une étape 14 (S14) follicule, voir la figure 1 et la figure 2H), et la moitié de la longueur du follicule est composé de cellules nourricièrestandis que l&#39;autre moitié est l&#39;ovocyte (Figure 1C). A ce stade, les cellules nourricières sont soumis dramatique remodelage de l&#39;actine, le renforcement de l&#39;actine corticale et générant des faisceaux parallèles de filaments d&#39;actine 2. Dans le même temps, une population de cellules de follicules, dite cellules centripètes, de migrer entre les cellules nourricières et l&#39;ovocyte, et deux groupes dorsales des cellules du follicule devient spécifiée à subir une migration pour former les appendices dorsaux, des appareils respiratoires tubulaires pour l&#39;embryon 3 . Les cellules nourricières puis contrat (S11), en serrant leur contenu cytoplasmique dans l&#39;ovocyte dans un processus appelé infirmière cellule dumping, qui fournit l&#39;ovule avec les facteurs nécessaires pour qu&#39;il puisse compléter l&#39;embryogenèse (figure 1D). Les cellules nourricières sont alors soumis à la mort cellulaire (S12-S13) 4, et les cellules folliculaires sécrètent et modèle la coquille 5 (figures 1E-G). Ainsi, la fin de l&#39;ovogenèse est riche avec un développement important ded processus morphogénétiques. Follicules isolés mi-à fin-scène (S10B-S14) peuvent être utilisés pour une variété de raisons, y compris des analyses moléculaires. Par exemple, l&#39;ARNm à partir de follicules étagés peut être isolée pour la RT-PCR, puces à ADN, l&#39;ARN ou des analyses-seq. Cela permet de regarder l&#39;expression des gènes au sein d&#39;une fenêtre de développement à court, avec seulement quelques types cellulaires présents, et de déterminer comment l&#39;expression des gènes est modifiée par des perturbations soit pharmacologiques ou génétiques. l&#39;isolement de l&#39;étape peut également être utilisé pour étudier des protéines par transfert de Western. Cette analyse est importante car elle permet de quantifier le niveau d&#39;expression de la protéine dans le type sauvage contre des mutants à des stades spécifiques. Alors que l&#39;on pourrait utiliser immunofluorescence analyse pour obtenir des résultats similaires, la quantification de la fluorescence est moins robuste en raison des exigences strictes que tous les pixels se situer dans la plage linéaire de détection 6. En outre, l&#39;analyse western blot peut fournir d&#39;autres informations, par exemple uns si la protéine est modifiée ou post-traductionnelle est exprimé à partir d&#39;une épissure isoforme spécifique. Étapes isolées peuvent également être utilisées pour une purification supplémentaire de la protéine, y compris fractionnement subcellulaire ou co-immunoprécipitation. L&#39;isolement du follicule spécifique du stade peut également être utilisé pour des essais in vitro de développement 7 et 8 d&#39;imagerie en temps réel. Isolés follicules S10B-S13 continueront à se développer à S14 dans les milieux de culture simples (voir ci-dessous). Il est important de noter que les follicules S10A ne seront pas progresser à travers infirmière cellule dumping en utilisant les conditions de culture abordées dans ce manuscrit. Nous avons utilisé S10B dans des essais in vitro de développement de définir le rôle des prostaglandines, à la fois sur le plan pharmacologique et génétique, dans la régulation de l&#39;actine remodelage en utilisant infirmière cellule le dumping et le développement-outs lire 7,9. De la même façon, les stades ultérieurs de développement peuvent également être isolées pour déterminer les effets des traitements pharmacologiques ou homme génétiqueipulations sur des procédés particuliers tels que la migration centripète de la cellule, la migration dorsale de l&#39;appendice / formation 10, et l&#39;infirmière la mort cellulaire. Ces tests peuvent être utilisés pour effectuer des écrans d&#39;interaction dominants ou les dosages, par exemple, alors que l&#39;hétérozygotie des mutations dans pxt ou fascine seuls n&#39;ont aucun effet sur ​​S10B développement in vitro, les follicules de doubles hétérozygotes exposition infirmière cellule de dumping défauts et un bloc dans le développement 9. En outre, parce S10B-13 peut se développer dans la culture, l&#39;ensemble des processus qui se produisent pendant cette période peut être observé par live-imagerie. Cette image peut être effectuée simplement en utilisant la lumière transmise (si l&#39;on est seulement intéressé par les variations brutes de la morphologie) ou la microscopie confocale en utilisant des mouches transgéniques exprimant des sondes ou des follicules colorées avec des teintures fluorescentes imagerie en direct. Imagerie en temps réel est utilisé pour faire avancer considérablement notre compréhension des processus de développement. En effet, vivre Imaging de follicules à un stade avancé a élargi la connaissance de la migration dorsale de l&#39;appendice, un exemple de tubulogenèse 10. Nous nous attendons à ce que l&#39;imagerie en direct de processus à un stade avancé supplémentaires, y compris la dynamique de l&#39;actine pendant infirmière cellule de dumping, fournira des informations nouvelles sur ces événements de développement. Il est important de noter que tandis que S10A et les premiers stades du développement du follicule ne va pas continuer à se développer en une S14 dans la culture, en direct-imagerie d&#39;événements survenus au cours de ces stades de développement est possible en utilisant des conditions de culture alternatifs 11-14 (voir discussion plus d&#39;informations). Ici nous fournissons des protocoles détaillés pour isoler follicules à un stade avancé de développement, soit in vitro et vivons-imagerie, ou des analyses moléculaires (ARNm et isolement des protéines).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1098">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:253px;">Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:195px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:227px;">62-103</td>
			<td style="width:424px;">Any source of Active Dry Yeast is fine</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Grace&#8217;s Insect Media</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-457F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat Inactivated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11050H</td>
			<td>Any Heat Inactivated FBS should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">10x Pen/Strep</td>
			<td>Gibco/Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pin Vises and Needles</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>13561-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Spot Plate, Nine Well</td>
			<td>Corning</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">#5 Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">24 multi-well plates</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>35 3226</td>
			<td>Any 24-well tissue culture dish should work</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coverslip Bottom Dishes (35mm)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td>Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-5x (for transferring follicles)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Glass pipettes - long</td>
			<td>Corning</td>
			<td colspan="2">7095B-9 (for producing pulled pipettes)</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;">Sample pestle (1.5 &#956;l; RNase/DNase free)</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>199228</td>
			<td>Any plastic pestle that fits 1.5 &#956;l microfuge tubes can be used</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trizol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the utility of stage-specific mid-to-late drosophila follicle isolation

Ovogenèse chez la drosophile ou le développement des follicules a été largement utilisé pour faire avancer la compréhension des processus biologiques de développement et cellulaires complexes. Ce document décrit comment des méthodes pour isoler les follicules de la scène mi-to-fin (étape 10B-14) et de les utiliser pour apporter de nouveaux éclairages sur les événements moléculaires et morphologiques survenant pendant fenêtres étanches de temps de développement. Follicules isolés peuvent être utilisés pour une variété de techniques expérimentales, y compris les essais in vitro de développement, l&#39;imagerie en temps réel, l&#39;analyse de l&#39;expression d&#39;ARNm et l&#39;analyse western blot des protéines. Follicules au stade 10B (S10B) ou plus tard viendront compléter le développement de la culture, ce qui permet de combiner des perturbations génétiques ou pharmacologiques avec le développement in vitro de définir les effets de ces manipulations sur les processus qui se produisent pendant des périodes spécifiques de développement. En outre, parce que ces follicules se développent en culture, elles sont idéales pour les études d&#39;imagerie en direct, Qui révèlent souvent de nouveaux mécanismes qui interviennent dans les événements morphologiques. Follicules isolées peuvent également être utilisées pour les analyses moléculaires. Par exemple, des changements dans l&#39;expression des gènes qui résultent de perturbations génétiques peuvent être définis pour des fenêtres spécifiques du développement. De plus, les taux de protéine, la stabilité et / ou l&#39;état de modification post-traductionnelle de pendant une étape particulière du développement des follicules peuvent être examinées par l&#39;intermédiaire des analyses western blot. Ainsi, l&#39;isolement spécifique au stade de follicules drosophile fournit une riche source d&#39;information dans les processus largement conservées du développement et de la morphogenèse.

Lorsque l&#39;isolement des stades spécifiques du développement folliculaire chez la drosophile, il est essentiel d&#39;être capable de distinguer avec précision les différentes étapes morphologiques. Ceci est quelque peu difficile pour les S10A et S10B, comme les cellules nourricières et l&#39;ovocyte prennent chacun la moitié de la longueur du follicule à ces stades (Figure 1B par rapport à 1C). Cependant, les follicules S10A sont plus courts en longueur que les fol...

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The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

L&#39;isolement spécifique du stade de-mi-à la fin de follicules de Drosophila est utile pour une variété de fins. Ces follicules se développent dans la culture, ce qui permet des manipulations génétiques et / ou pharmacologiques pour être couplés avec des essais in vitro de développement et de l&#39;imagerie en temps réel. En outre, les follicules peuvent être utilisées pour des études moléculaires, telles que l&#39;isolement de l&#39;ARNm et des protéines.

L&#39;utilitaire de la phase spécifique-mi-à la fin<em&gt; Drosophila</em&gt; Folliculo Isolation

Drosophila oogenesis or follicle development has been widely used to advance the understanding of complex developmental and cell biologic processes. This ...

the-utility-stage-specific-mid-to-late-drosophila-follicle

Research

JoVE Journal

Biology

The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation

11.2K vues.  University of Iowa Carver College of Medicine.  L'isolement spécifique du stade de-mi-à la fin de follicules de Drosophila est utile pour une variété de fins. Ces follicules se développent dans la culture, ce qui permet des manipulations génétiques et / ou pharmacologiques pour être couplés avec des essais in vitro de développement et de l'imagerie en temps réel. En outre, les follicules peuvent être utilisées pour des études moléculaires, telles que l'isolement de...

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Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

Expression ciblée de la GFP dans le follicule pileux ex vivo utilisant transduction virale

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Recherche

Biologie

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells that align along each side of the heart wall, supportive alary muscles and, in adults, a layer of ventral longitudinal muscle cells. The contractile fibers house conserved constituents of the muscle cytoarchitecture including densely packed bundles of myofibrils and cytoskeletal/submembranous protein complexes, which interact with homologous components of the extracellular matrix. Here we describe a protocol for the fixation and the fluorescent labeling of particular myocardial elements from the hearts of dissected larvae and semi-intact adult Drosophila. Specifically, we demonstrate the labeling of sarcomeric F-actin and of &alpha;-actinin in larval hearts. Additionally, we perform labeling of F-actin and &alpha;-actinin in myosin-GFP expressing adult flies and of &alpha;-actinin and pericardin, a type IV extracellular matrix collagen, in wild type adult hearts. Particular attention is given to a mounting strategy for semi-intact adult hearts that minimizes handling and optimizes the opportunity for maintaining the integrity of the cardiac tubes and the associated tissues. These preparations are suitable for imaging via fluorescent and confocal microscopy. Overall, this procedure allows for careful and detailed analysis of the structural characteristics of the heart from a powerful genetically tractable model system.

Fluorescent Labeling of Drosophila Heart Structures

Here we describe a basic protocol for fluorescent labeling of different elements of heart tubes from larva and adult Drosophila melanogaster. These specimens are well-suited for imaging via fluorescent or confocal microscopy. This technique permits detailed structural analysis of the features of the hearts from a powerful model organism.

Marquage fluorescent Drosophile</emOuvrages d&#39;art> Coeur

The Drosophila melanogaster dorsal vessel, or heart, is a tubular structure comprised of a single layer of contractile cardiomyocytes, pericardial cells ...

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in myogenic hearts. A key step in examining heart function in the fly is finding a way to access the heart in a manner that preserves its myogenic function while still allowing the beating heart organ to be observed and recorded. Two different methods for observing and recording the beating heart in both larva and adult Drosophila are described here. Our semi-intact preparation using adult flies allows clear visualization of the abdominal heart without interference from the pigmented cuticle and overlying fat bodies. To record larval heart beats it is necessary to immobilize the larva, which minimizes body wall movements thereby reducing heart movements that are not associated with myocardial contractions. Our methodologies produce stable adult and larval heart preparations that can beat for hours at rates of 1-3 Hz.

Visualizing the Beating Heart in Drosophila

Technique required for visualizing the beating heart in larval and adult Drosophila are presented. Each life stage requires a different methodology.

Visualiser le cœur battant Drosophile</em

The Drosophila heart has recently emerged as a good model system for examining the genetic, cellular, and molecular mechanisms underlying function in ...

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite morphogenesis at the functional and molecular levels. To aid in these analyses, we have developed a strategy for the isolation of a subclass of PNS neurons called dendritic arborization (da) neurons that have been widely used for studying dendrite morphogenesis1,2. These neurons are very difficult to isolate as a pure population, due in part to their extremely low occurrence and their difficult-to-reach location below the tough chitinous larval cuticle. Our newly developed method overcomes these challenges, and is based on a fast and specific cell enrichment using antibody-coated magnetic beads. For our magnetic bead sorting studies, we have used age-matched third instar larvae expressing a mouse CD8 tagged GFP fusion protein (UAS-mCD8-GFP)3 under the control of either the class IV dendritic arborization (da) neuron-specific pickpocket (ppk)-GAL4 driver4 or the control of the pan-da neuron-specific GAL421-7 driver5. Although this protocol has been optimized for isolating PNS cells which are attached to the inner wall of the larval cuticle, by varying a few parameters, the same protocol could be used to isolate many different cell types attached to the cuticle at larval or pupal stages of development (e.g. epithelia, muscle, oenocytes etc.), or other cell types from larval organs depending upon the GAL4-specific driver expression pattern. The RNA isolated by this method is of high quality and can be readily used for downstream genomic analyses such as microarray gene expression profiling studies. This approach offers a powerful new tool to perform studies on isolated Drosophila dendritic arborization (da) neurons thereby providing novel insights into the molecular mechanisms underlying dendrite morphogenesis.

Isolation and Purification of Drosophila Peripheral Neurons by Magnetic Bead Sorting

In this video-article we present a method for the isolation and purification of Drosophila peripheral neurons using a fast magnetic bead assisted cell sorting strategy. RNA obtained from the isolated cells can be readily used for downstream applications including microarray analyses.

Isolement et purification de Drosophile Neurones périphériques en triant bille magnétique

The Drosophila peripheral nervous system (PNS) is a powerful model for investigating the complex processes of neuronal development and dendrite ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolement des Drosophila melanogaster Testicules

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolement et purification de la kinésine de Drosophila Embryons

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

Isolation basée sur l&#39;affinité de Tagged noyaux de<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolation des néonatale extrahépatique cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolement des cellules endothéliales murines Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...