Ce travail a été soutenu par des subventions du Fonds national belge pour scienti fi de la recherche (FNRS), l&#39;Pôles d&#39;attraction interuniversitaires Programme-belge Politique scientifique et les «Communauté française de Belgique-Actions de Recherches Concertées&quot; FC, de la Fondation Israël science Jérusalem ( ISF) à MM (Grant # 1311-1312), et à NM (Grant # 1312-1312).

1 Préparation de solutions <ol><li> Préparer isotonique (600 mOsm) et hypotonique (500 mOsm) des solutions contenant 10 mM de KCl, CaCl2 1 mM, et 8 M 2 (N-morpholine) d&#39;acide -ethanesulphonic (MES), pH 5,7 et ajuster l&#39;osmolarité avec les quantités appropriées d&#39; D-sorbitol: 540 mm pour les isotonique et 440 mM pour la solution hypotonique. Vérifier l&#39;osmolarité de la solution (à moins de 3% de la valeur cible) à l&#39;aide d&#39;un osmomètre. </li><li> Préparer une pâte sèche de «mélange enzymatique» contenant les enzymes suivantes: 0,55 g cellulases, 0,1 g pectolyase, 0,33 g de polyvinylpyrrolidone K 30, 0,33 g de BSA (voir le tableau 1 ci-dessous), mélanger la poudre sèche par vortex, faire 5,7 mg aliquotes et stocker à -20 ° C. </li></ol> 2 Arabidopsis L&#39;isolement de protoplastes de mésophylle <ol><li> Préparer une boîte de Pétri (10 cm) avec environ 6 gouttes (env. 30 ul chacun) de solution isotonique. </li><li> Peler les abaxiales Les épiderme (inférieure) de feuilles d&#39;Arabidopsis, cut la feuille pelée en carrés d&#39;environ 4 x 4 mm 2, puis placez les carrés sur la solution isotonique gouttes avec le côté abaxiale exposé vers le bas, touchant la solution. </li><li> Dissoudre 5,7 mg du mélange d&#39;enzymes dans 165 ul solution isotonique (3,3% p / p) dans un tube de 1,5 ml, mélanger doucement par pipetage pour une minute ou jusqu&#39;à dissolution, et placer quelques gouttes semblables de la solution enzymatique dans le même Petri plat. </li><li> Transférer les morceaux de feuilles sur la solution enzymatique gouttes, fermer le plat d&#39;étanchéité du couvercle avec un tour de parafilm et incuber pendant 20 min, flottant le plat dans un bain-marie réglé à 28 ° C. </li><li> Ajouter quelques gouttes d&#39;une solution isotonique de l&#39;antenne (2 gouttes par chaque goutte de solution enzymatique). Transfert de chaque morceau de feuille à une nouvelle goutte de solution isotonique, puis, successivement, à une seconde goutte (pour laver la solution enzymatique loin). Soulevez la pièce par son bord en utilisant une pince, serrer dans la deuxième chute (comme un sachet de thé) pour libérer les protoplastes.Recueillir les gouttes avec les protoplastes (à l&#39;aide d&#39;une pipette 100 ul rognée) dans un tube de 1,5 ml. </li></ol> 3 L&#39;hypotonie Défi test: gonflement cellulaire Arabidopsis Mésophylle <ol><li> Préparer le système de perfusion (figure 1A) en remplissant une colonne avec la solution isotonique et une autre colonne avec la solution hypotonique. Ouvrir la vanne, et encore un certain écoulement de la solution (la première hypotonique, puis la isotonique) pour remplir le tube tout en bas de la tubulure d&#39;admission (figure 1B). Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air, puis fermer la vanne. </li><li> Sceller une lamelle, avec de la graisse de silicone (tableau 1), pour faire un fond pour la chambre dans la diapositive en plexiglas (figure 1B, voir aussi les schémas de la chambre à la figure 1C). Pour rendre le fond de la chambre (la surface vers le haut face exposée de la lamelle dans la couronne de graisse) &quot;collante&quot; pour protoplastes, enduireavec le sulfate de protamine-portant une charge positive (à 1% dans l&#39;eau, tableau 1) ou la poly-L-lysine (0,1% dans l&#39;eau; tableau 1). Fais tourner ce «colle» sur la lamelle à l&#39;aide d&#39;une pipette, attendre 1 - 2 min, rincer 3 - 4 fois avec la solution isotonique et secouer loin la solution restante. </li><li> Remplir la chambre avec la solution isotonique. Ensuite, ajoutez une goutte de protoplastes contenant une solution à la chambre, à l&#39;aide d&#39;une pipette coupée et attendre 3 - 4 min pour les protoplastes se déposer. Couvrir la chambre avec un couvercle transparent (figures 1D, 1E) de toucher la surface de la solution (éviter la formation de bulles sous). </li><li> Placer la lame (doucement!) Sur une table de microscope inversé, connectez-le au système de perfusion et la pompe (se prémunir contre des bulles d&#39;air dans le tube!) Et tourner sur le flux de solution isotonique pour perfusion constante à 1 ml / min (vitesses plus rapides peut être utilisé, à 4 ml / min). </li><li> Pour l&#39;enregistrementles variations de volume, un microscope inversé est utilisé, avec un objectif 20X et avec une caméra vidéo CCD reliée à un ordinateur de type PC. Utilisez la CMU 1394 Camera Driver &quot;plug-in du logiciel ImageJ (voir la Table des Matières spécifiques pour les adresses de téléchargement de ces deux morceaux de logiciels) pour enregistrer une vidéo film de 60 secondes de protoplastes immobiles sélectionnés (sans doute, ceux qui sont coincés au fond) à une vitesse de 1 image / seconde (1 Hz). Lancer l&#39;enregistrement avec un lavage à 15 sec de la solution isotonique (ce qui constitue la ligne de base), l&#39;interrupteur de la solution hypotonique pendant 45 s (pour compléter un total de 60 s à partir du début de la perfusion). Enregistrer le film en format TIF. REMARQUE: Choisissez un champ de vision avec autant de cellules que possible, répondant aux critères suivants: sphériques en forme et avec un contour de cellule bien ciblée à leur plus grand périmètre (figure 2A). </li></ol> 4. analyse de l&#39;évolution cellulaire de volume à l&#39;aide ImageJ REMARQUE: Pour analyser l&#39;série d&#39;images d&#39;un gonflement cellulaire, utilisez le &#39;Image Explorer »et plugins&#39; Protoplast Analyzer» dans le logiciel ImageJ (écrit par Xavier Draye) 14. En commençant par les protoplastes choisis à leur premier point de temps, le plugin le &#39;Protoplast Analyzer »détecte automatiquement les protoplastes bords (contours) et de calculer le cours du temps de leurs domaines au cours de l&#39;expérience (les plugins sont disponibles avec le programme d&#39;analyse PfFit, ci-dessous) . <ol><li> Lancer ImageJ. Pour ouvrir le film, cliquez sur «Fichier» sur le panneau ImageJ, puis, successivement sur les menus déroulants tels qu&#39;ils se déroulent: «Importer», puis «de Image Explorer. Mettez en surbrillance le film choisi, puis faites un clic droit dessus, puis clic gauche sur &quot;Protoplast Analyzer». Parcourez le film (à l&#39;aide d&#39;un curseur à l&#39;image du bas de protoplastes) d&#39;identifier les protoplastes qui restent en grande partie immobiles pendant l&#39;expérience - ils seront analysés. Retour sur la première image, à l&#39;aide de la souris, tracer des cercles (cueillies dans les outils de dessin de ImageJ) autour des protoplastes sélectionnés (figure 2B), puis cliquez sur «OK» dans le tableau des &quot;paramètres de détection» qui sont apparus. </li><li> Pour lancer l&#39;algorithme de détection de protoplastes, cliquez sur «Local» sur le panneau supérieur de l&#39;image de protoplastes, puis «processus» dans le menu déroulant. Examiner les cercles verts autour des protoplastes sélectionnés (figure 2C) tout au long du film. Enregistrez le «Résultats» dans un fichier Excel. Quitter ImageJ. NOTE: Dans le cas où un point rouge apparaît (pour indiquer une mauvaise contour en forme - le plus souvent en raison d&#39;un contraste d&#39;image médiocre), relancez avec des paramètres différents. </li><li> Pour séparer les lignes appartenant à chaque cellule (qui - si deux ou plusieurs cellules ont été analysées simultanément - sera liée, parce que l&#39;analyse se fait image par image), dans Excel, trier les données enregistrées par la colonne du nombre de cellules (&#39;objet&#39; ). </li><li> Pour DeTermine le facteur de conversion pixel-à-um pour obtenir la valeur réelle de P f, casser l&#39;image d&#39;un dirigeant du micromètre par le même objectif 20X de microscope. Faites glisser une ligne (cueillis dans les outils de dessin de ImageJ) le long de l&#39;image de la règle et de lire le nombre de pixels équivalente à la longueur de la règle dans le bas du panneau principal ImageJ. Convertir les valeurs de la zone pixel arbitraires dans le fichier Excel dans um 2. Enregistrer le cours zones de temps (pour chaque cellule séparément) sous forme de fichier texte (deux colonnes de chiffres uniquement). NOTE: Ce sera une contribution au programme de volume ajusté &#39;PfFit. </li></ol> 5 Modélisation du taux de osmolarité changement dans la Chambre expérimentale utilisant ImageJ et le programme Matlab P f Fit <ol><li> Ajouter 2 mg xylene cyanol (tableau 1, ci-dessous) à 100 ml de la solution isotonique (pour produire le «colorant indicateur). </li><li> Préparer le système de perfusion (comme en 3.1) avec le colorant indicateur et le non-teinte hsolution ypotonic. </li><li> Sceller une lamelle avec de la graisse de silicium au fond de la chambre en plexiglas, puis versez doucement la chambre avec le colorant indicateur, couvrir avec une lamelle (comme avec les protoplastes avant) et le placer sur la platine du microscope. </li><li> Connectez la chambre au système de perfusion et de la pompe, et tourner sur le flux colorant indicateur pour une perfusion constante à l ml / min. </li><li> Enregistrer un film de 60 secondes à la fréquence de 1 Hz. Lancer l&#39;enregistrement avec 15 sec de colorant indicateur, passer à la solution hypotonique pendant 45 sec. Arrêter de filmer. Rincer avec de l&#39;indicateur Dye (au moins pour 30 sec), puis commencer un nouveau film. Répétez environ 5 - 6 fois et enregistrer tous les films </li><li> Utiliser le logiciel ImageJ à analyser les images vidéo de la transmittance colorant indicateur d&#39;obtenir une évolution dans le temps de la modification moyenne de la transmittance. <ol><li> Lancer ImageJ, cliquez sur «Fichier», puis, «Ouvrir», et parcourir pour le film. Pour chaque film, dessiner un 10 pixels de large verticalrectangle n&#39;importe où sur le 1 er image du film. Cliquez sur &quot;Image&quot; sur le panneau principal ImageJ, puis cliquez sur «culture» dans le menu déroulant. </li><li> Pour aligner les 60 images (du film de 60 secondes) dans une rangée, cliquez à nouveau sur &quot;Image&quot;, puis cliquez sur consécutivement dans les menus déroulants tels qu&#39;ils se déroulent: «Stacks» et «Faire Montage&quot; (colonnes 60, lignes 1). Dessinez un 1 pixel de haut rectangle horizontal partout sur toute la rangée d&#39;images et cliquez sur &quot;Analyser&quot; dans le panneau principal ImageJ, puis cliquez sur le profil de complot »dans le menu déroulant. REMARQUE: Un «Terrain de Montage« fenêtre apparaîtra (non représenté), et une liste de données de transmission peuvent être ouverts à partir de son menu. Chaque image du film est représenté dans cette liste de 10 valeurs de transmission provenant de son 10 pixels de large rectangle et par conséquent la &quot;base de temps&quot; (l&#39;image numéro séquentiel) est 10 fois plus longtemps. </li><li> Copiez les listes de la dat de transmissionun (une liste par film) vers un fichier Excel. La moyenne des cours de temps de transmittance obtenus à partir des plusieurs films des bouffées de colorant indicateur. Générer une véritable base de temps en multipliant l&#39;image numéro séquentiel de 0,1. Enregistrez le cours du temps en moyenne (deux colonnes) dans un fichier texte. NOTE: Avant la moyenne, si on le souhaite, tracer les cours à temps individuels, de rejeter toute irrégularité. Assurez-vous que le film comprend au moins 5 sec finale de l&#39;état stable de transmission du colorant indicateur. </li></ol></li><li> Démarrez le programme Matlab raccord P f Fit (panneau du «indicateur Fit&quot;, Figure 3) pour calculer les différents paramètres de l&#39;évolution dans le temps de l&#39;osmolarité. Remarque: sur la base des concentrations initiales et finales connues de la solution dans le bain, au cours du temps de la concentration osmotique changement de la solution est calculée à partir de l&#39;évolution temporelle de la concentration (calculée en retour à partir de la transmission de l&#39;indicateur de colorant), en supposant qu&#39;il suit la même dynamique que laconcentration de colorant. P f Fit est un programme disponible pour une utilisation gratuite. Le «PfFit_Installer_web.exe &#39;peut être téléchargé à partir de: P f Guide des coupes de l&#39;utilisateur» avec des explications et des définitions détaillées est accessible via Jupiter dans un fichier supplémentaire, ce qui contribue à familiariser l&#39;utilisateur avec le programme Fit P f. </li><li> Dans le panneau «indicateur Fit&quot;, importer les données de l&#39;évolution dans le temps moyen de la transmission Indicateur Dye («fichier de données Indicateur», figure 3A) et insérer manuellement les paramètres expérimentaux actuels et les estimations initiales de de la largeur &#39;les paramètres et&#39; t_half &quot;décrivant l&#39;évolution temporelle de la concentration du colorant indicateur (figure 3B. Cliquez sur&quot; Exécuter &quot;pour afficher les courbes des cours à temps de la concentration du colorant indicateur (données réelles et en forme, figure 4A), et de la valeur calculée) bain modélisé ( osmolarité (figure 4B). REMARQUE: agood ajustement aux données est indispensable (recommandation: commencer par les valeurs indiquées dans la figure 3). </li></ol> 6 Détermination de la f de P en utilisant le programme d&#39;ajustement de Matlab P f Fit NOTE: En plus des hypothèses de base en ce qui concerne le comportement d&#39;un protoplaste comme un osmomètre vraie et parfaite 11, la détermination de P f repose sur la présomption que P f peut changer avec le temps, que cette dynamique de P f sous-tend le temps cours de la variation de volume de la cellule et que les trois paramètres suffisent pour le décrire: P fi (la valeur initiale de P f), la pente Pf (le taux de la variation linéaire de P f) et de retard (la période allant du début de la baignoire changement de l&#39;osmolarité jusqu&#39;au début de la variation de volume de la cellule). Différents modèles peuvent être testés, y compris différentes combinaisons de ces paramètres et leurs valeurs, y compris les valeurs nulles 11. P <sub&gt; f Fit cherche la meilleure combinaison de ces paramètres pour obtenir - par calcul - la reproduction la plus fidèle de l&#39;évolution dans le temps expérimentale de la variation de volume de la cellule 11, calculé, à son tour, de la série importés de zones cellulaire contour (voir aussi le complémentaire &#39;P f Guide Fit de l&#39;utilisateur »). <ol><li> Passez au volet &#39;Volume Fit&#39; (figure 5). Choisissez pour l&#39;importation du fichier de données sur les aires (le fichier texte avec le cours du temps des «zones» de protoplastes analysés, figure 5A). Choisissez l&#39;option «Dernière indicateur de pose» comme source de paramètres (figure 5B, voir le &#39;P f Fit Guide de l&#39;utilisateur »pour des solutions de rechange). REMARQUE: Ces paramètres (figure 5D) est ensuite utilisé pour régénérer le changement osmotique dans le bain pendant les volumes procédure d&#39;ajustement. </li><li> Dans le panneau «Volume Fit &#39;(figure 5C), initialiser (remplir les estimations initiales pour) les P f paramètres: P f, pente Pf et Delay (recommandation: commencer par 1, 1, et 30, respectivement), a choisi le modèle &#39;Class&#39; (une recommandation: commencer par II et marque «contrôles» pour les trois paramètres qui doivent être montées). Cliquez sur &quot;Exécuter&quot;, puis globe oculaire le chiffre provisoire (Figure 5E) et régler le paramètre Delay et la longueur de l&#39;enregistrement, si nécessaire. </li><li> Examinez le graphique des résultats (Figure 6) pour évaluer la qualité en forme et enregistrer l&#39;erreur ajustement. Modifiez les paramètres d&#39;initialisation un peu plier chaque, et re-&#39;Run. NOTE: Ne vous découragez pas lorsque le programme est bloqué - juste redémarrer le programme! </li><li> Répéter cette procédure plusieurs fois, en commençant par différentes combinaisons de paramètres d&#39;initialisation, en vue de la plus faible valeur de l&#39;erreur est nécessaire. </li><li> Copiez la liste des résultats ajustement directement à partir de l&#39;écran, ou les trouver en til PfFit généré le fichier &#39;_FIT_Vol_Results.txt. </li></ol>

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	<li>Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+aquaporins:+multifunctional+water+and+solute+channels+with+expanding+roles.">Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles.</a> Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).</li><li>Maurel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+aquaporins:+Novel+functions+and+regulation+properties.">Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties.</a> Febs Letters. 581, 2227 (2007).</li><li>Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+aquaporins:+Membrane+channels+with+multiple+integrated+functions.">Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions.</a> Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).</li><li>Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+plant+aquaporin+activity.">Regulation of plant aquaporin activity.</a> Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).</li><li>Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmotic+water+permeability+of+isolated+protoplasts.+Modifications+during+development.">Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development.</a> Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).</li><li>Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+aquaporin+levels+among+cell+types+of+radish+and+measurement+of+osmotic+water+permeability+of+individual+protoplasts.">Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts.</a> Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).</li><li>Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bundle-sheath+cell+regulation+of+xylem-mesophyll+water+transport+via+aquaporins+under+drought+stress:+a+target+of+xylem-borne+ABA?.">Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA?.</a> The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).</li><li>Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+and+quantification+of+plasma+membrane+aquaporin+expression+in+maize+primary+root:+A+clue+to+understanding+their+role+as+cellular+plumbers.">Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers.</a> Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).</li><li>Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+pattern+of+plasma+membrane+aquaporins+in+maize+leaf+highlights+their+role+in+hydraulic+regulation.">The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation.</a> Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).</li><li>Besserer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+regulation+of+maize+plasma+membrane+aquaporin+trafficking+and+activity+by+the+SNARE+SYP121.">Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121.</a> The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).</li><li>Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+the+osmotic+water+permeability+of+protoplast+plasma+membrane.">Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane.</a> Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).</li><li>Moshelion, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+water+permeability+and+aquaporin+expression+increase+during+growth+of+maize+suspension+cultured+cells.">Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells.</a> Plant, Cell &amp; Environment. 32, 1334-1345 (2009).</li><li>Sade, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+plant+stress+tolerance+and+yield+production:+is+the+tonoplast+aquaporin+SlTIP2;2+a+key+to+isohydric+to+anisohydric+conversion?.">Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion?.</a> New Phytologist. 181, 651-661 (2009).</li><li>Volkov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+permeability+differs+between+growing+and+non-growing+barley+leaf+tissues.">Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues.</a> J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).</li><li>Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+transient+transformation+in+tobacco+protoplasts+is+independent+of+plasmid+amount.">Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount.</a> Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).</li><li>Hosy, E., Duby, G., V&#233;ry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+localisation+and+electrophysiological+characterisation+of+ion+channels+heterologously+expressed+in+a+plant+context.">A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context.</a> Plant Methods. 19, (2005).</li><li>Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Recombinant+Type+I+Collagen+Produced+in+Plants.">Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants.</a> Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).</li></ol>

We have nothing to disclose.

Décrit ici est un procédé simple et très efficace pour la mesure de la P f de protoplastes végétaux isolés, en principe applicable aussi à d&#39;autres cellules sphériques, par exemple., Les ovocytes de grenouille 11. Cette méthode est basée sur la mesure de la P f en réponse à un défi osmotique de la cellule. A la différence des autres méthodes basées sur cette approche, cependant, le changement de solutions, à savoir, d&#39;osmolarité, n&#39;est pas...

L&#39;absorption d&#39;eau et le débit à travers les membranes cellulaires est une exigence fondamentale pour l&#39;existence de l&#39;usine à la fois au niveau de la plante entière et cellulaire. Au niveau cellulaire, les aquaporines (AQP) jouent un rôle clé dans la régulation du coefficient de perméabilité à l&#39;eau osmotique (P f) de la membrane de la cellule 1-3. A ce jour, plusieurs procédés ont été utilisés pour mesurer la f P endogène de protoplastes à partir de différents organes de la plante (par exemple les racines, le mésophylle, endoderme, etc., Examiné par Chaumont et al. 4). L&#39;une des approches pour mesurer P f est d&#39;exposer les protoplastes à un défi osmotique et à contrôler la vitesse initiale de sa variation de volume (c.-à-., La pente de la phase précoce, linéaire de la variation de volume). Deux méthodes différentes ont été décrites précédemment sur la base de cette approche, tous les deux basés sur un échange instantané de solutions. La première consiste à immobilizment le protoplaste avec une micropipette d&#39;aspiration et le passage du flux de la solution 5 et la deuxième consistant à transférer l&#39;un protoplaste d&#39;une solution à l&#39;autre à l&#39;aide d&#39;une micropipette 6. Ces méthodes de transfert micropipette d&#39;aspiration et de micropipette, qui permettent l&#39;acquisition d&#39;images au début de l&#39;échange de solution rapide (pour capturer la phase linéaire début de changement de volume), impliquera probablement un stress physique de protoplastes et nécessitent un équipement spécialisé et micromanipulation expert. Le procédé décrit ici minimise la perturbation des cellules, comporte aucun micromanipulation et permet la dérivation de P f lorsque la perfusion de bain n&#39;est pas instantanée. Après la digestion enzymatique, les protoplastes, immergées dans une solution isotonique, sont immobilisés sur le fond de la lamelle couvre-objet en verre une Plexiglas (aka Lucite ou plexiglas) chambre par interaction de charges. Puis, au cours d&#39;une perfusion constante de bain,la solution isotonique est rincée par la solution hypotonique générer un défi hypoosmotique aux protoplastes. Le gonflement du protoplaste est une vidéo enregistrée et ensuite, en combinant les informations sur le déroulement dans le temps de la perfusion de bain et le déroulement dans le temps de gonflement de la cellule, le P f est déterminée par traitement d&#39;image et des procédures d&#39;ajustement de courbe. Les avantages de cette méthode sont que l&#39;expérience est très efficace, c&#39;est à dire qu&#39;il est possible de suivre quelques cellules simultanément dans un seul essai, et qu&#39;il ne nécessite pas d&#39;équipement spécial ou des compétences particulières de micromanipulation. Plusieurs applications de cette méthode sont possibles. Par exemple, la détermination de P f natif d&#39;une variété de cellules provenant de différents tissus et des plantes, tels que mésophylle et regrouper les cellules de la gaine de feuille 7 Arabidopsis, maïs mésophylle des feuilles ou des cellules du cortex des racines 8-10 ou les cellules cultivées en suspension 11,12. En additisur, il est possible de déterminer P f de cellules animales telles que des cellules sphériques d&#39;ovocytes 11. Un autre exemple concerne l&#39;examen de l&#39;activité PAQ par l&#39;expression transitoire de leur gène dans les protoplastes (ou d&#39;autres gènes susceptibles de les toucher; par exemple, les gènes de kinases) et la détermination de leur contribution à P f; par exemple, l&#39;expression de tomate AQP SlTIP2; 2 dans les protoplastes d&#39;Arabidopsis de PEG par transformation et la détermination SlTIP2; deux liés P f 13. Enfin, l&#39;examen de l&#39;effet sur ​​P f de différentes molécules / substances (médicaments, hormones, etc) ajouté à des solutions peuvent également être examinée, par exemple du bloqueur PAQ HgCl2 7. Le protocole suivant décrit l&#39;isolement de protoplastes des cellules et la détermination de leur P f Arabidopsis de.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:288px;">KCl</td>
			<td style="width:140px;">Chem-Impex International</td>
			<td style="width:159px;">01247-1</td>
			<td style="width:516px;"><a href="http://www.chemimpex.com/">http://www.chemimpex.com</a> 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:288px;">CaCl2</td>
			<td style="width:140px;">Merck</td>
			<td style="width:159px;">11718006</td>
			<td><a href="http://www.merck.com/">http://www.merck.com</a> 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:288px;">2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">15152002</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:288px;">D-Sorbitol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">18032003</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com 
			Any source, anal. grade</td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:288px;">Cellulase</td>
			<td style="width:140px;">Worthington, Lakewood, NJ, USA</td>
			<td style="width:159px;">LS002603</td>
			<td><a href="http://www.worthingtonbiochem.com/">http://www.worthingtonbiochem.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:288px;">Pectolyase</td>
			<td style="width:140px;">Karlan,&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Phonix, AZ, USA</td>
			<td style="width:159px;">8006</td>
			<td><a href="http://www.karlan.com/">http://www.karlan.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:288px;">Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">81420</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:288px;"><a href="https://my.labguru.com/catalog/materials/216">Bovine Serum Albumin (BSA)</a></td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">A9418-5G</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">http://www.sigmaaldrich.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:288px;">Protamine sulphate</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P4380</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P8920</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:140px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">X4126</td>
			<td>http://www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:288px;">Silicone vacuum grease heavy</td>
			<td style="width:140px;">Merck</td>
			<td style="width:159px;">107921</td>
			<td><a href="https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&amp;SEO_ErrorPageOccurred=true&amp;attachments=CoA">https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&#38;SEO_ErrorPageOccurred=true&#38;attachments=CoA</a></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;">Inverted microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100/TS100F</td>
			<td><a href="http://www.nikoninstruments.com/">http://www.nikoninstruments.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;">Peristaltic pump</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td style="width:159px;">EP-1 Econo&#160;Pump</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;">Grayscale digital camera</td>
			<td>Scion Corporation</td>
			<td style="width:159px;">CFW-1308M</td>
			<td><a href="http://www.scioncorp.com/">http://www.scioncorp.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">CMU 1394 Camera Driver&#8217; plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:140px;">Carnegie Mellon</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html">http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html</a> 
			Free software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ</td>
			<td style="width:140px;">NIH</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> 
			Free software</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Econo Gradient Pump Fittings Kit</td>
			<td style="width:140px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:159px;">731-9006</td>
			<td><a href="http://www.bio-rad.com/">http://www.bio-rad.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Connectors, manifold</td>
			<td style="width:140px;">DirectMed</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S">http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Burette infusion sets (columns)</td>
			<td style="width:140px;">Welford</td>
			<td style="width:159px;">IF-BR-001</td>
			<td>http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tubing</td>
			<td style="width:140px;">TYGON</td>
			<td style="width:159px;">R-3603</td>
			<td><a href="http://www.usplastic.com/">http://www.usplastic.com</a></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plexiglass slide etc.</td>
			<td style="width:140px;">Perspectiv</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.perspectiv.co.il/index-en.html">http://www.perspectiv.co.il/index-en.html</a> 
			Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as &#39;a copy of the slide already made for M. Moshelion&#39;.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">3M packaging Scotch tape 1&#39;&#39;, clear</td>
			<td style="width:140px;">Viking Industrial, UK</td>
			<td style="width:159px;">VKMONO25</td>
			<td><a href="http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8">http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8</a> 
			any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring the osmotic water permeability coefficient (pf) of spherical cells: isolated plant protoplasts as an example

L&#39;étude des mécanismes de régulation PAQ est cruciale pour la compréhension des relations de l&#39;eau, tant au niveau de la plante entière et cellulaire. Présenté ici est une méthode simple et très efficace pour la détermination du coefficient de perméabilité à l&#39;eau osmosée (P f) dans des protoplastes végétaux, en principe applicable aussi à d&#39;autres cellules sphériques telles que les ovocytes de grenouille. La première étape de l&#39;analyse est l&#39;isolement de protoplastes à partir du tissu de la plante d&#39;intérêt par digestion enzymatique dans une chambre avec une solution isotonique appropriée. La deuxième étape consiste en un test de provocation osmotique: protoplastes immobilisés sur le fond de la chambre sont soumises à une perfusion constante de départ avec une solution isotonique et suivis par une solution hypotonique. Le gonflement de la cellule est une vidéo enregistrée. Dans la troisième étape, les images sont traitées hors ligne pour donner des changements de volume, et l&#39;évolution dans le temps des changements de volume sont corrélées avec l&#39;évolution temporelle de la variation de la osmolarité de la chambre à fluide de perfusion, en utilisant une procédure d&#39;ajustement de courbe écrit dans Matlab (la PfFit &#39;), pour obtenir P f.

Afin de déterminer la P f et comparer l&#39;activité des différents AQP, les protoplastes du mésophylle des feuilles de Arabidopsis sont utilisés. Ces protoplastes ont été trouvés à avoir de faibles basale (arrière-plan) des niveaux P f 7 et peuvent servir comme un système fonctionnel d&#39;expression pour permettre des mesures P f reproductibles. Protoplastes d&#39;une feuille adulte à partir d&#39;une ancienne usine d&#39;Arabidopsis ...

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Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

La mesure du coefficient de perméabilité à l&#39;eau osmotique (P f) de cellules peut aider à comprendre les mécanismes de régulation de aquaporines (AQP). P f détermination dans des protoplastes de cellules végétales sphériques présentées ici implique l&#39;isolement de protoplastes et l&#39;analyse numérique de leur taux initial de changement de volume à la suite d&#39;une faute de osmotique au cours de la perfusion de bain constant.

La mesure de la perméabilité à l&#39;eau Coefficient osmotique (P<sub&gt; F</sub&gt;) Des cellules sphériques: protoplastes de plantes isolées comme un exemple

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

measuring-osmotic-water-permeability-coefficient-pf-spherical-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

15.9K vues.  The Hebrew University of Jerusalem.  La mesure du coefficient de perméabilité à l'eau osmotique (P f) de cellules peut aider à comprendre les mécanismes de régulation de aquaporines (AQP). P f détermination dans des protoplastes de cellules végétales sphériques présentées ici implique l'isolement de protoplastes et l'analyse numérique de leur taux initial de changement de volume à la suite d'une faute de osmotique au cours de la perfusion de bain constant....

Vidéo: Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network function1. These proteins are found at the presynaptic and postsynaptic membranes 2. Studies in mice indicate that neurexins and neurologins have an essential role in synaptic transmission 1. Recent reports have shown that altered neuronal connections during the development of the human nervous system could constitute the basis of the etiology of numerous cases of autism spectrum disorders 3.
Caenorhabditis elegans could be used as an experimental tool to facilitate the study of the functioning of synaptic components, because of its simplicity for laboratory experimentation, and given that its nervous system and synaptic wiring has been fully characterized. In C. elegans nrx-1 and nlg-1 genes are orthologous to human NRXN1 and NLGN1 genes which encode alpha-neurexin-1 and neuroligin-1 proteins, respectively. In humans and nematodes, the organization of neurexins and neuroligins is similar in respect to functional domains.
The head of the nematode contains the amphid, a sensory organ of the nematode, which mediates responses to different stimuli, including osmotic strength. The amphid is made of 12 sensory bipolar neurons with ciliated dendrites and one presynaptic terminal axon 4. Two of these neurons, named ASHR and ASHL are particularly important in osmotic sensory function, detecting water-soluble repellents with high osmotic strength 5. The dendrites of these two neurons lengthen to the tip of the mouth and the axons extend to the nerve ring, where they make synaptic connections with other neurons determining the behavioral response 6.
To evaluate the implications of neurexin and neuroligin in high osmotic strength avoidance, we show the different response of C. elegans mutants defective in nrx-1 and nlg-1 genes, using a method based on a 4M fructose ring 7. The behavioral phenotypes were confirmed using specific RNAi clones 8. In C. elegans, the dsRNA required to trigger RNAi can be administered by feeding 9. The delivery of dsRNA through food induces the RNAi interference of the gene of interest thus allowing the identification of genetic components and network pathways.

Osmotic Avoidance in Caenorhabditis elegans: Synaptic Function of Two Genes, Orthologues of Human NRXN1 and NLGN1, as Candidates for Autism

Neurexins and neuroligins are membrane-neuron adhesion proteins which perform essential roles in synaptic differentiation and transmission. Neuroligin deficient mutants of C. elegans are defective in detecting osmotic strength, but when they also contain a mutation in the gene coding neurexin, they recover the wild type phenotype.

Évitement osmotique Caenorhabditis elegans: La fonction synaptique de deux gènes, orthologues de l&#39;homme NRXN1 Et NLGN1, Comme candidats pour l&#39;autisme

Neurexins and neuroligins are cell adhesion molecules present in excitatory and inhibitory synapses, and they are required for correct neuron network ...

Recherche

Biologie

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Mesure de la rigidité à la flexion des cellules bactériennes utilisant un piège optique

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Measuring the Kinetics of mRNA Transcription in Single Living Cells

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in vivo is of importance. Pol II kinetics have been measured using biochemical or molecular methods.1-3 In recent years, with the development of new visualization methods, it has become possible to follow transcription as it occurs in real time in single living cells.4 Herein we describe how to perform analysis of Pol II elongation kinetics on a specific gene in living cells.5, 6 Using a cell line in which a specific gene locus (DNA), its mRNA product, and the final protein product can be fluorescently labeled and visualized in vivo, it is possible to detect the actual transcription of mRNAs on the gene of interest.7, 8 The mRNA is fluorescently tagged using the MS2 system for tagging mRNAs in vivo, where the 3'UTR of the mRNA transcripts contain 24 MS2 stem-loop repeats, which provide highly specific binding sites for the YFP-MS2 coat protein that labels the mRNA as it is transcribed.9 To monitor the kinetics of transcription we use the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) method. By photobleaching the YFP-MS2-tagged nascent transcripts at the site of transcription and then following the recovery of this signal over time, we obtain the synthesis rate of the newly made mRNAs.5 In other words, YFP-MS2 fluorescence recovery reflects the generation of new MS2 stem-loops in the nascent transcripts and their binding by fluorescent free YFP-MS2 molecules entering from the surrounding nucleoplasm. The FRAP recovery curves are then analyzed using mathematical mechanistic models formalized by a series of differential equations, in order to retrieve the kinetic time parameters of transcription.

RNA polymerase II transcriptional kinetics are measured on specific genes in living cells. mRNAs transcribed from the gene of interest are fluorescently tagged and using Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) the in vivo kinetics of transcriptional elongation are obtained.

Mesure de la cinétique de la transcription d&#39;ARNm dans les cellules vivantes simples

The transcriptional activity of RNA polymerase II (Pol II) is a dynamic process and therefore measuring the kinetics of the transcriptional process in ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is avoided when the herbivore is able to select other plants2. Antibiosis is the degree to which the plant affects the fitness of the herbivore feeding on it1.Tolerance is the degree to which the plant can withstand or repair damage caused by the herbivore, without compromising the herbivore's growth and reproduction1. The durability of herbivore resistance in an agricultural setting depends to a great extent on the resistance mechanism favored during crop breeding efforts3.
We demonstrate a no-choice experiment designed to estimate the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp. Several species of African grasses of the genus Brachiaria are valuable forage and pasture plants in the Neotropics, but they can be severely challenged by several native species of spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae)4.To assess their resistance to spittlebugs, plants are vegetatively-propagated by stem cuttings and allowed to grow for approximately one month, allowing the growth of superficial roots on which spittlebugs can feed. At that point, each test plant is individually challenged with six spittlebug eggs near hatching. Infestations are allowed to progress for one month before evaluating plant damage and insect survival. Scoring plant damage provides an estimate of tolerance while scoring insect survival provides an estimate of antibiosis. This protocol has facilitated our plant breeding objective to enhance spittlebug resistance in commercial brachiariagrases5.

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

This video explains mechanisms of host plant resistance to herbivory and demonstrates a no-choice test that estimates the relative contributions of antibiosis and tolerance to spittlebug resistance in Brachiaria spp.

Caractériser les mécanismes de résistance Herbivores: cercopes sur Brachiaria Spp. comme un exemple

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-paramètres de mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantifier simple microvaisseaux perméabilité d&#39;isolement de poumon de rat Préparation du sang perfusé

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

La technique d&#39;infiltration-centrifugation pour l&#39;extraction de apoplastique Fluid feuilles des plantes Utilisation<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;, Un exemple

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Rapid Analysis of Circadian Phenotypes in Arabidopsis Protoplasts Transfected with a Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable biotic and abiotic stress. Conversely, disruption of circadian timekeeping severely compromises plant health and reduces agricultural crop yields. It is therefore imperative that we understand the intricate regulation of circadian rhythms in plants, including the factors that affect motion of the transcriptional clockwork itself.
Testing circadian defects in the model plant Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) traditionally involves crossing specific mutant lines to a line rhythmically expressing firefly luciferase from a circadian clock gene promoter. This approach is laborious, time-consuming, and could be fruitless if a mutant has no circadian phenotype. The methodology presented here allows a rapid initial assessment of circadian phenotypes. Protoplasts derived from mutant and wild-type Arabidopsis are isolated, transfected with a rhythmically expressed luminescent reporter, and imaged under constant light conditions for 5 days. Luminescent traces will directly reveal whether the free-running period of mutant plants is different from wild-type plants. The advantage of the method is that any Arabidopsis line can efficiently be screened, without the need for generating a stably transgenic luminescent clock marker line in that mutant background.

The circadian clock regulates about a third of the Arabidopsis transcriptome, but the percentage of genes that feed back into timekeeping remains unknown. Here we visualize a method to rapidly assess circadian phenotypes in any mutant line of Arabidopsis using luminescent imaging of a circadian reporter transiently expressed in protoplasts.

Analyse rapide des phénotypes circadiens dans Arabidopsis protoplastes transfectées avec un Luminescent Clock Reporter

The plant circadian clock allows the anticipation of daily changes to the environment. This anticipation aids the responses to temporally predictable ...

Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. Furthermore, chloroplasts are critical for plant responses to various abiotic stresses, such as salinity and osmotic stresses. A chloroplast may contain up to ~3,000 different proteins, some of which are encoded by its own genome. However, the majority of chloroplast proteins are encoded in the nucleus and synthesized in the cytosol, and these proteins need to be imported into the chloroplast through translocons at the chloroplast envelope membranes. Recent studies have shown that the chloroplast protein import can be actively regulated by stress. To biochemically investigate such regulation of protein import under stress conditions, we developed the method described here as a quick and straightforward procedure that can easily be achieved in any laboratory. In this method, plants are grown under normal conditions and then exposed to stress conditions in liquid culture. Plant material is collected, and chloroplasts are then released by homogenization. The crude homogenate is separated by density gradient centrifugation, enabling isolation of the intact chloroplasts. Chloroplast yield is assessed by counting, and chloroplast intactness is checked under a microscope. For the protein import assays, purified chloroplasts are incubated with 35S radiolabeled in vitro translated precursor proteins, and time-course experiments are conducted to enable comparisons of import rates between genotypes under stress conditions. We present data generated using this method which show that the rate of protein import into chloroplasts from a regulatory mutant is specifically altered under osmotic stress conditions.

Here we describe a new method to study protein import into isolated chloroplasts under stress. The method is rapid and straightforward, and can be applied to study the consequences of different stress conditions for chloroplast protein import, and the corresponding regulatory mechanisms.

Analyse des protéines d&#39;importation dans les chloroplastes isolés de plantes stressées

Chloroplasts are organelles with many vital roles in plants, which include not only photosynthesis but numerous other metabolic and signaling functions. ...