Ce travail est soutenu par l&#39;Office État de New York de la Science, technologie et recherche universitaire (NYSTAR) (sous la forme d&#39;un Centre for Advanced Technology de subvention), et par des subventions du Centre nanobiotechnologie (NBTC), un programme national de la STC Science Foundation vertu de l&#39;Accord n ​​° ECS-9876771, et l&#39;Association américaine du cerveau de la tumeur et la New York Academy of Medicine (JAB).

Procédure Revêtement avec diapositives fibronectine Avant le montage du dispositif microfluidique, stériliser les lames de verre avec de la fibronectine. Enduire les diapositives dans une biohood pour maintenir la stérilité. Aligner une entretoise stériles PDMS sur les bords de la lame et de marquer le côté qui est tourné vers le haut avec un marqueur permanent. Pipeter 1 ml d&#39;une 5 pg / ml solution de fibronectine (Sigma) à l&#39;intérieur de l&#39;entretoise PDMS sur l&#39;ensemble de la lame de verre. Laisser les lames au repos pendant une heure, puis sécher complètement l&#39;aide d&#39;une arme de N 2. Les diapositives peuvent être conservés à 4 o C pour les expériences ultérieures. L&#39;assemblage du dispositif Le protocole ensemble du dispositif de montage est fait dans un biohood dans des conditions stériles, en utilisant les procédures suivantes: <ol><li> Nettoyer le maître de silicium avec des microcanaux calqué sur lui par l&#39;essuyer avec 70% d&#39;éthanol et séchage avec le N 2 pistolet. Placez une entretoise stériles PDMS de 1 mm de hauteur à l&#39;aide des pinces autour des reliefs du maître. </li><li> Préparer le gel d&#39;agarose utilisée dans le dispositif en pesant 0,3 g de poudre d&#39;agarose (Fisher Scientific) et 10 ml de CO 2-médias indépendants (Invitrogen) dans un bécher de 50 ml. Remuer le mélange avec une spatule et de chaleur dans un four micro-ondes pendant 20 secondes sur HAUT. Si granules insolubles sont présentes, chauffer le mélange pendant 10 secondes et agiter le mélange chaud pour se débarrasser des granules derniers. Répétez le processus avec un temps de chauffage de 8 secondes, puis 5 secondes. </li><li> Verser rapidement la solution d&#39;agarose sur le maître de silicium entouré par l&#39;entretoise PDMS et couvrir immédiatement le mélange d&#39;agarose avec une lame de verre stérile. Appliquer une pression constante et douce à la diapositive pendant environ 2 minutes pour s&#39;assurer que l&#39;agarose gel sera à la même constante de 1 mm de hauteur que l&#39;entretoise PDMS. </li><li> Après les gels d&#39;agarose, décollez le gel d&#39;agarose à motifs avec l&#39;entretoise PDMS par le maître de silicium et le transfert d&#39;une lame de verre recouvert de fibronectine avec les microcanaux dans le gel d&#39;agarose face à la diapositive. Utilisez un bout de la seringue de calibre 16 pour perforer des trous dans les régions de réservoir des microcanaux pour l&#39;entrée et accède sortie. Ajouter 500 pi de CO 2-médias indépendants au gel d&#39;agarose à motifs sur la lame pour éviter le dessèchement des microcanaux. </li><li> Lavez le collecteur d&#39;acryliques utilisés dans le dispositif à l&#39;éthanol 70% et rincer à l&#39;eau DI. Alignez les trous dans le collecteur avec les trous percés dans le gel d&#39;agarose avec les microcanaux. Ensuite, aligner le collecteur avec le gel, l&#39;entretoise PDMS, et la lame de fibronectine avec le châssis métallique de l&#39;appareil. Placez les vis dans le dispositif et serrer au point de résistance en utilisant un tournevis. Ceci est fait pour s&#39;assurer que le dispositif n&#39;est pas trop serré au point de déformer les microcanaux de l&#39;agarose. Serrez les vis dans un sens horaire pour s&#39;assurer que le gel de l&#39;intérieur du dispositif ne se déplace pas. Test de l&#39;appareil pour détecter les fuites et des blocages dans les microcanaux aide d&#39;une seringue de 1ml. La seringue est équipée avec des tubes en Tygon avec une pipette de gel de chargement à l&#39;extrémité de la tubulure d&#39;injecter du CO 2 des médias indépendants dans les microcanaux. Un microcanal est réputé formé avec succès lorsque le support est observé que la sortie de la sortie du microcanal lorsque le support est injecté dans l&#39;entrée correspondante. Maintenant, l&#39;appareil est prêt à l&#39;emploi. </li></ol> Préparation et d&#39;ensemencement des cellules dans l&#39;appareil Lorsque les cellules atteignent 70% (densité cellulaire environ 100.000 cellules / ml) de confluence, elles sont prêtes à être ensemencées dans l&#39;appareil. Objet des cellules à deux DPBS (Invitrogen) lavages. Ajouter 200 ul de trypsine-EDTA (Invitrogen) pour détacher les cellules. Transférer les cellules dans un tube de 15 ml contenant 5 ml de centrifugeuse médias M2 contenant du sérum pour inactiver la trypsine. Centrifugé le milieu de croissance avec les cellules à 1000 rpm pendant 5 minutes. Aspiré le surnageant et resuspendre le culot de cellules de 5 ml de DPBS. Centrifuger les cellules DPBS nouveau dans les mêmes conditions. Aspiré le surnageant à nouveau, et remettre le culot de cellules dans 500 ul de CO 2-médias indépendants. Graine de la suspension résultante de cellules dans le centre de microcanaux de l&#39;appareil via par gravité débit. Ajouter l&#39;entrée et la sortie du centre de microcanaux avec 60 ul de la suspension cellulaire et 20 pi de CO 2 moyennes indépendantes, respectivement. Observez le centre sous un microscope à microcanaux fond clair pour chercher l&#39;adhésion cellulaire. Les cellules adhèrent généralement au bout de 10 minutes. Après que les cellules adhèrent au fond du canal à une densité adéquate, pipeted la suspension de cellules restant dans l&#39;entrée et les médias dans la prise. Placer 60 l de CO 2-médias indépendants dans les deux entrée et de sortie du canal central. Placez PDMS couvre plus ee centre d&#39;entrée et de sortie pour minimiser l&#39;évaporation des médias à partir du canal du centre. Imagerie des cellules dans l&#39;appareil Avant l&#39;assemblage de l&#39;appareil, le fil de la tubulure stérile péristaltique à travers la station météorologique du microscope (Olympus X81) et se connecter avec la pompe péristaltique (Watson-Marlow 205U/CA). Rincer PBS à travers le tube à un taux de 4 tours. Après le montage du dispositif, préparer des concentrations appropriées du facteur de croissance épidermique (EGF) (Sigma) des solutions dans le CO 2-médias indépendants dans un des tubes de 15 ml centrifugeuse. Vortex les solutions EGF pendant 5 secondes et se connecter avec le tube. Connectez les tuyaux marqués avec des concentrations FEM correspondant à l&#39;appareil. Il faut environ une heure pour le FEM à diffuser à travers la crête de canal et d&#39;établir un gradient chimique stable. Un logiciel d&#39;imagerie, Slidebook, est utilisé pour prendre une série d&#39;images à toutes les 10 minutes pendant environ 5 heures dans une période d&#39;expérimentation. Le XY automatisé est programmé de telle sorte que deux sous-domaines (chacun avec une superficie de 400 microns x400μm) du canal de ce même centre, et un total de trois canaux du centre sont imagées à un instant donné. Les cellules dans les canaux du centre différents (typiquement 3 en un seul passage) ont des concentrations différentes du FEM, comme indiqué sur le tube. Matériel et équipement Les lignées de cellules: les cellules sont C17.2 NSCs issus de la couche externe du cervelet de souris germinales postnatales 6, 7. En utilisant cette lignée cellulaire, nous avons développé deux autres lignées de cellules souches murines en utilisant la méthode de transfection rétrovirus. Ces deux lignées de cellules transfectées de façon stable sont (1) wtEGFR - qui surexprime l&#39;EGFR humain de type sauvage, et (2) ΔEGFR - qui est un mutant constitutivement actif EGFR. Pour faciliter la détection, les rétrovirus réaliser une dorsale avec le gène d&#39;intérêt suivie par un site interne pour la liaison du ribosome (IRES) et la protéine fluorescente verte (GFP). La culture cellulaire: La souris C17.2 CNS et leurs variantes ont été cultivées dans une plaque de 6 puits dans M2 médias (DMEM (Invitrogen) avec 10% sérum de veau fœtal (FBS) (Invitrogen), cheval de 5% de sérum (SH) (Invitrogen ), et 1% de pénicilline / streptomycine (Invitrogen).) Les cellules ont été maintenues à 37 ° C dans l&#39;air de 80% et 5% de CO 2. Dispositif microfluidique: Un collecteur en plastique, une entretoise PDMS, et un châssis inoxydable pour maintenir le dispositif en place. Imagerie Un microscope inversé fluorescente (Olympus IX-81) est utilisé, en relation avec une caméra CCD intensifiée (Orca, Hamamatsu). Le dispositif microfluidique est monté sur une scène automatisé xyz, et le stade est fermé par une enceinte environnementale qui maintient une température de 37 o C. Il ya généralement des dispositifs 3-4 sur la même puce qui sera tourné au point même temps en utilisant la scène automatisés XYZ. Débit maintien Une pompe péristaltique avec 8 lignes parallèles (Watson-Marlow 205U/CA) automatique est utilisée pour maintenir les flux dans l&#39;ensemble de l&#39;évier et des canaux de source. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_6/674_Figure-01.jpg" alt="Figure 1" width="573" height="414" /> Fig. Une motilité des souches de NSC trois (parents, wtEGFR et D R-EGF) dans des concentrations différentes FEM Toutes les trajectoires sont tirées d&#39;un film suivi de 5 heures (sauf pour wtEGF 100ng/ml, 4 heures), et l&#39;origine de toutes les pistes ont été repositionné à (0,0) à des fins de comparaison. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_7/674_Figure-02.jpg" alt="Figure 2" width="576" height="546" /> Fig. 2 Corrélation du niveau d&#39;expression de l&#39;EGFR et la motilité (a) deux images de NSCs wtEGF sur la surface d&#39;un canal microfluidique avec 100ng/ml FEM. L&#39;image de gauche est une image fluorescente, et la droite est une image de champ transmis lumineux. La barre d&#39;échelle est 100 microns, et le Largeur du chenal est de 400 um. Les cellules sont séparées en deux populations par l&#39;éclat de la GFP exprimée. Cellules dans les cercles bleus sont gradateur, donc le niveau d&#39;expression EGFR moins, et les cellules dans les cercles rouges sont brigher, donc niveau supérieur expression de l&#39;EGFR. (B) Trajectoires des cellules avec le niveau d&#39;expression EGFR basse et haute. Ces trajectoires sont prises à partir de quatre heures de temps de film.

<ol>
	<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+in+search+of+a+killer+application.">Microfluidics: in search of a killer application.</a> Nature Methods. 4, 665-670 (2007).</li><li>Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. a. x., Archer, S. h. i. v. a. u. n., Shuler, M. i. c. h. a. e. l. . L., Wu, M. i. n. g. m. i. n. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogel-based+microfluidic+device+for+the+studies+of+directed+cell+migration.">A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration.</a> Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).</li><li>Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+naturally+occurring+constitutively+active+variant+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+mouse+fibroblasts+increases+motility.">Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility.</a> Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).</li><li>Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duality+of+EGFR+signaling+and+neural+stem+cell+phenotype:+Cell+enhancer+or+cell+transformer.">The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer.</a> Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).</li><li>Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellents+for+Escherichia+coli+operate+neither+by+changing+membrane+fluidity+nor+by+being+sensed+by+periplasmic+receptors+during+chemotaxis.">Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis.</a> J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).</li><li>Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+cell+lines+can+engraft+and+participate+in+development+of+mouse+cerebellum.">Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum.</a> Cell. 68, 33-51 (1992).</li><li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex.">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).</li></ol>

Fig. 1 montre les trajectoires de souches NSC trois, les cellules parentales, le wtEGFR et le ΔEGFR (contrôle). Chaque ensemble de trajectoires ont été obtenus à partir d&#39;un film 5 heures de temps. Pour les cellules parentales, la motilité cellulaire atteint son paroxysme lorsque la concentration du FEM a été ~ 10ng/ml; pour les cellules wtEGFR, la motilité cellulaire de pointe déplacé vers 100ng/ml ou au-dessus, car les cellules ΔEGFR, la motilité cellulaire était indépendante de la concentration du FEM comme prévu. </p...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11971-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-independent media</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18045-088</td>
<td>A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10437-028</td>
<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
</tr>
<tr>
<td>Horse Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050-130</td>
<td>Horse Serum, EIA tested (negative) serum</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F0895</td>
<td>Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E4127</td>
<td>Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Reagent</td>
<td>FisherScientific</td>
<td>BP1356-500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing neural stem cell motility using an agarose gel-based microfluidic device

Bien que la technologie microfluidique a atteint un nouveau niveau de maturité pour les dosages macromoléculaire, dosages cellulaires sont encore à un stade infantile 1. Ceci est largement dû à la difficulté avec laquelle on peut créer un microenvironnement cellulaire compatible et stable en utilisant des techniques de microfabrication et des matériaux conventionnels. Nous abordons ce problème via l&#39;introduction d&#39;un matériau de microfabrication révolutionnaires, gel d&#39;agarose, comme matériau de base pour le dispositif microfluidique. Gel d&#39;agarose est très malléable et perméable au gaz et les nutriments nécessaires à la survie cellulaire, et donc un matériau idéal pour des essais cellulaires. Nous avons montré précédemment que les dispositifs à base de gel d&#39;agarose ont été couronnés de succès dans l&#39;étude de la migration des cellules bactériennes et des neutrophiles 2. Dans ce rapport, trois en parallèle des canaux microfluidiques sont modelés dans une membrane de gel d&#39;agarose d&#39;environ 1mm d&#39;épaisseur. Flux constant avec les médias / tampons sont maintenues dans les deux canaux latéraux à l&#39;aide d&#39;une pompe péristaltique. Les cellules sont maintenues dans le canal du centre pour l&#39;observation. Depuis les nutriments et les produits chimiques dans les canaux secondaires sont constamment diffuser sur le côté pour le canal central, de l&#39;environnement chimique du canal central est facilement contrôlée via le flux le long des canaux latéraux. En utilisant ce dispositif, nous démontrons que le mouvement des cellules souches neurales peuvent être surveillés optiquement avec aisance dans des conditions chimiques différentes, et les résultats expérimentaux montrent que la surexpression du facteur de croissance épidermique récepteurs (EGFR) améliore la motilité des cellules souches neurales. La motilité des cellules souches neurales est un biomarqueur important pour évaluer l&#39;agressivité des cellules, par conséquent le facteur tumorigène 3. Décrypter les mécanismes sous-jacents motilité NSC donnera un aperçu de ces deux troubles du développement neural et dans le cancer du cerveau des cellules souches d&#39;invasion.

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Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Nous démontrons que la surexpression du facteur de croissance épidermique récepteurs (EGFR) améliore la motilité des cellules souches neurales (NSC) en utilisant un roman sur gel d&#39;agarose dispositif basé microfluidique. Cette technologie peut être facilement adaptable à d&#39;autres systèmes cellulaires de mammifères où les sources de cellules sont rares, telles que des cellules souches neurales, et le tour autour du temps est critique.

Évaluer la motilité Neural Stem Cell utilisant un gel d&#39;agarose à base dispositif microfluidique

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.6K vues.  Cornell University. Nous démontrons que la surexpression du facteur de croissance épidermique récepteurs (EGFR) améliore la motilité des cellules souches neurales (NSC) en utilisant un roman sur gel d'agarose dispositif basé microfluidique. Cette technologie peut être facilement adaptable à d'autres systèmes cellulaires de mammifères où les sources de cellules sont rares, telles que des cellules souches neurales, et le tour autour du temps est critique.

Vidéo: Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

Culture de la souris de neurones précurseurs de cellules souches

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

Recherche

Biologie

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Fabrication d&#39;un dispositif microfluidique pour la compartimentation du Neuron Soma et des axones

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

Comptage des cellules souches humaines

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

Le repiquage des cellules souches humaines

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest, most commonly a protein, in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable researchers to conserve primary and secondary antibodies while getting high quality, reproducible qualitative and quantitative data out of their staining. There are two aspects of this protocol that help to conserve the volume of antibody necessary for staining. For one, the cells are grown on small, circular coverslips that are placed in wells of a tissue culture plate. After fixation, the cells on coverslips can be removed from the wells of the plate. For antibody staining, the coverslip with cells is inverted onto a small drop of antibody solution on parafilm and is covered with a second piece of parafilm to prevent drying. Using this method, only ~25 &mu;l of antibody solution is needed for each coverslip (or sample) to be stained. This protocol describes immunostaining of human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can be used for many other cell types.

Immunocytochemistry is a powerful method to determine the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable one to conserve antibodies and get the most out of one's staining.

Immunocytochimie: des cellules souches humaines

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

Un dispositif microfluidique avec des modèles Groove pour étudier le comportement cellulaire

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un dispositif microfluidique Dégradé génératrices de biologie cellulaire

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Préparation E18 neurones de rat corticale compartimentation dans un dispositif microfluidique

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

Capturez cellule à l&#39;aide d&#39;un dispositif microfluidique

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond devices to the Corning No. 1 cover glass.  This could be due, perhaps, to a plasma cleaner not being available.  In other instances, it may be desirable to remove the device from the glass after the culturing of neurons for certain types of microscopy or for immunostaining, though it is not necessary to remove the device for immunostaining since the neurons can be stained in the device.  Some researchers, however, still prefer to remove the device.  In this case, reversible bonding of the device to the cover glass makes that possible.  There are some disadvantages to non-plasma bonding of the devices in that not as tight of a seal is formed.  In some cases axons may grow under the grooves rather than through them.  Also, because the glass and PDMS are hydrophobic, liquids do not readily enter the device making it necessary at times to force media and other reagents into the device.  Liquids will enter the device via capillary action, but it takes significantly longer as compared to devices that have been plasma bonded.  The plasma cleaner creates temporary hydrophilic charges on the glass and device that facilitate the flow of liquids through the device after bonding within seconds.  For non-plasma bound devices, liquid flow through the devices takes several minutes.  It is also important to note that the devices to be used with non-plasma bonding need to be sterilized first, whereas plasma treated devices do not need to be sterilized prior to use because the plasma cleaner will sterilize them.

In this video we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.

Non du plasma Collage de PDMS pour fabrication bon marché de dispositifs microfluidiques

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond ...