この作品は、科学、技術及び学術研究（NYSTAR）（先端技術助成のためのセンターの形で）、のニューヨーク州事務所でとナノバイオテクノロジーセンター（NBTC）、ナショナルのSTCプログラムからの補助金によってサポートされています契約書第ECS - 9876771の下で科学財団、およびアメリカの脳腫瘍協会と医学のニューヨークアカデミー（JAB）。

手順フィブロネクチンでコーティングスライドマイクロ流体デバイスの組み立てに先立って、フィブロネクチンでガラススライドを滅菌する。コー​​ト無菌性を維持するためにbiohoodにスライド。スライドのエッジに沿って滅菌PDMSのスペーサーの位置を合わせ、永久的なマーカーで上を向いている側をマーク。スライドガラスの全体にわたってPDMSのスペーサー内部のフィブロネクチンの5μg/ mlの溶液をピペット1ミリリットル（シグマ）。時間邪魔されずにスライドを残し、その後N 2銃を使用して完全に乾燥させます。スライドは、後の実験のために4℃で保存することができる。 装置の組み立てデバイス全体のアセンブリのプロトコルは、次の手順を使用して、無菌条件下でbiohoodで行われます。 <ol><li> 70％エタノールでそれを消去し、N 2ガ ​​ンで乾燥することによりその上にパターニングされたマイクロチャネルを有するシリコンのマスターを清掃してください。マスターのリリーフ機能周り鉗子を使用して1mmの高さの滅菌PDMSのスペーサを置きます。 </li><li>アガロース粉末（フィッシャーサイエンティフィック社）0.3 gと50 mlのビーカーにCO 2に依存しないメディア（Invitrogen社製）10mlを秤量することにより、デバイスで使用されているアガロースゲルを準備します。 HIGHで20秒間電子レンジでへらと熱との混合物をかき混ぜる。未溶解の顆粒が存在する場合は、最後に残った顆粒を取り除くために熱い混合物は、別の10秒とスワールのために混合物を加熱する。 8秒の加熱時間とプロセスを繰り返し、[5秒。 </li><li>すぐにPDMSのスペーサーに囲まれたシリコンのマスターにアガロース溶液を注ぐと直ちに滅菌ガラススライドでアガロースの混合物をカバーしています。アガロースは、PDMSのスペーサーと同じ定数1 mmの高さにゲルすることを保証するために約2分間スライドに一定の、穏やかな圧力を与える。 </li><li>アガロースゲルの後に、シリコンのマスターとスライドが直面しているアガロースゲルのマイクロとフィブロネクチンコーティングしたスライドガラスへの転送からPDMSスペーサーと模様のアガロースゲルをはがす。入口と出口のアクセスのためのマイクロチャネルの貯留領域に穴を開けるために16ゲージのシリンジの先端を使用してください。マイクロチャネルの乾燥を防ぐために、スライド上にパターニングされたアガロースゲルにCO 2 -独立系メディアの500μlを添加します。 </li><li> 70％エタノールでデバイスで使用されるアクリルマニホールドを洗浄し、DI水ですすいでください。マイクロチャネルをアガロースゲルにパンチ穴付マニホールドの穴を合わせます。その後、ゲル、PDMSのスペーサー、およびデバイスの金属フレームとのフィブロネクチンのスライドにマニホールドを合わせます。デバイスにネジを置いて、ドライバーを使って抵抗の点で締めます。これは、デバイスはアガロースのマイクロチャネルを変形の程度に過剰締めされていないことを保証するために行われます。デバイス内部のゲルがずれないことを確認する時計回りの順番でネジを締めます。 1ミリリットル注射器を使用してマイクロチャネルに漏れや閉塞のためのデバイスをテストします。注射器は、マイクロチャネル内のCO 2 -独立系メディアを注入するチューブの端にゲルローディングピペットチップとタイゴンチューブが装備されています。マイクロチャネルは、メディアが、メディアが対応する入口に注入されたときにのみマイクロチャンネルの出口を終了することが観察されている場合、正常に形成みなされます。今、デバイスの使用準備ができています。 </li></ol>デバイス内のセルを準備し、シーディング細胞がコンフルエント70％（100,000細胞/ ml程度の細胞密度）に到達すると、それらはデバイスに播種されるために準備されています。 two DPBS（Invitrogen）を洗浄の対象セルを。細胞を切断するトリプシン- EDTA（Invitrogen社）を200μlを追加。トリプシンを不活性化する血清を含むM2培地5mlを含む15 mlの遠心チューブに細胞を移す。 5分間1000rpmで細胞を増殖培地を遠心分離。上清を吸引し、細胞のペレットをDPBS 5 mlを懸濁します。同じ条件で再びDPBS細胞を遠心分離します。再び上清を吸引し、CO 2の独立したメディアの500μlに細胞のペレットを再懸濁します。 重力駆動型フローを介してデバイスのマイクロ流路中心に種子細胞の得られた懸濁液を。それぞれ、細胞懸濁液60μlおよびCO 2非依存培地の20μlを持つマイクロチャネルセンターの入口と出口を追加。細胞接着を探すために明視野顕微鏡下でマイクロチャネルセンターを守ってください。細胞は通常10分後に付着する。細胞は適切な密度でチャネルの底部に付着した後、入口で、残りの細胞懸濁液と出口でメディアをpipeted。センターチャンネルの入口と出口の両方でCOの場所60μlの2 -独立系メディア。場所PDMSは、番目以上をカバーセンターチャンネルからのメディアの蒸発を最小限に抑えるために、電子センターの入口および出口。 撮像素子のセル顕微鏡の気象観測所（オリンパスX81）を介して滅菌ルティックチューブスレッド、装置の組立に先立ちと蠕動ポンプ（ワトソン - マーロウ205U/CA）で接続します。 4 RPMの速度でチューブをPBSをフラッシュします。装置の組み立て後、15 ml遠心チューブ内のCO 2 -独立系メディアにおける上皮成長因子（EGF）（シグマ）ソリューションの適切な濃度を準備する。 5秒間ボルテックスEGFソリューションを、チューブで接続してください。デバイスに対応するEGF濃度が付いているチューブを接続します。 EGFは、チャネルの尾根を越え拡散し、安定した化学的勾配を確立するためのそれは約1時間かかります。 イメージングソフトウェア、Slidebookは、実験の実行で約5時間10分ごとに時の画像のセットを取得するために使用されます。 XY自動ステージは、このような2同一のセンターチャンネルのサブ領域（400μmx400μmの面積を持つ）、および3つの中心チャネルの合計にプログラムされている特定の時点で撮像する。チューブに記載されて別のセンターチャネル（通常、3一度の実行で）の細胞は、異なるEGF濃度を有する。 材料と機器 細胞株：C17.2細胞は出生後のマウスの小脳6,7の外部胚層から派生したのNSCです。この細胞株を使用して、我々はレトロウイルスのトランスフェクション法を使用して、2つの他のマウスの幹細胞株を開発した。これら二つの安定にトランスフェクトされた細胞株は、（1）wtEGFRです - ヒト野生型EGFRを過剰発現する、と（2）ΔEGFR - その構成的に活性EGFRの変異体である。検出の容易さのために、レトロウイルスは、リボソーム結合（IRES）および緑色蛍光タンパク質（GFP）のための内部サイトに続いて興味の遺伝子を持つバックボーンを運ぶ。 細胞培養：マウスC17.2のNSCとその変種が10％ウシ胎児血清（FBS）（インビトロジェン社）とM2培地（DMEM（Invitrogen社）、5％ウマ血清（HS）（Invitrogen社で6 -ウェルプレートで増殖させた）、および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen社）。）細胞は、80％空気、5％CO 2で37℃に維持した。 マイクロ流体デバイス：プラスチックマニホールド、PDMSのスペーサー、所定の位置にデバイスを保持するためのステンレスフレーム。 イメージング倒立蛍光顕微鏡（オリンパスIX - 81）が激化CCDカメラ（オルカ、浜松）に関連して、使用されています。マイクロ流体デバイスは、自動XYZステージ上に搭載され、そして舞台は37 o Cでの温度を維持し、環境チャンバーで囲まれている自動XYZステージを使用して、同じ時点で撮影される同チップ3-4デバイスが通常あります。 維持流量オートはシンクとソースのチャンネルのすべてのフローを維持するために使用される8本の平行線（ワトソン - マーロウ205U/CA）と蠕動ポンプ。 <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_6/674_Figure-01.jpg" alt="図1" width="573" height="414" /> 図。 1様々なEGF濃度の三NSC株（親、wtEGFR、およびD EGFR）の運動はすべて軌道が5時間の映画を追跡から取得されます（wtEGF 100ng/mlの、4hourを除く）、およびすべてのトラックの原点があった比較のために（0,0）で再配置。 <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_7/674_Figure-02.jpg" alt="図2" width="576" height="546" /> 図。 EGFRの発現レベルと運動性の2相関 （）100ng/mlのEGFとマイクロ流体チャネルの表面上にwtEGF NSCの二つの画像。 左の画像は、蛍光画像であり、右が送信される明視野像である。 スケールバーは100μmのです、と チャネル幅は400μmである。 細胞は、発現したGFPの明るさによって2つの集団に分けられています。 細胞 青い円は調光器ですで、このように少ないEGFR発現のレベルを持っていると、赤の円内のセルはbrigherです、したがって、より高いEGFRの発現レベルを持っている。低および高EGFRの発現レベルと細胞の（b）の軌道。これらの軌道は4時間の映画から取られます。

<ol>
	<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+in+search+of+a+killer+application.">Microfluidics: in search of a killer application.</a> Nature Methods. 4, 665-670 (2007).</li><li>Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. a. x., Archer, S. h. i. v. a. u. n., Shuler, M. i. c. h. a. e. l. . L., Wu, M. i. n. g. m. i. n. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogel-based+microfluidic+device+for+the+studies+of+directed+cell+migration.">A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration.</a> Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).</li><li>Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+naturally+occurring+constitutively+active+variant+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+mouse+fibroblasts+increases+motility.">Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility.</a> Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).</li><li>Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duality+of+EGFR+signaling+and+neural+stem+cell+phenotype:+Cell+enhancer+or+cell+transformer.">The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer.</a> Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).</li><li>Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellents+for+Escherichia+coli+operate+neither+by+changing+membrane+fluidity+nor+by+being+sensed+by+periplasmic+receptors+during+chemotaxis.">Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis.</a> J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).</li><li>Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+cell+lines+can+engraft+and+participate+in+development+of+mouse+cerebellum.">Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum.</a> Cell. 68, 33-51 (1992).</li><li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex.">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).</li></ol>

図。 1は3つのNSC株、親細胞、wtEGFRとΔEGFR（コントロール）の軌跡を示しています。軌跡の各セットは、5時間の長い映画から得た。 EGFの濃度は〜10ng/mlだったとき、親の細胞の場合は、細胞の運動性は、ピーク、wtEGFR細胞について、細胞運動のピークは100ng/mlのまたは上記にシフトし、期待通りにΔEGFR細胞について、細胞の運動性は、EGFの濃度とは独立していた。 100ng/mlの持つwtEGF細胞はほとんどの運動?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11971-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-independent media</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18045-088</td>
<td>A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10437-028</td>
<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
</tr>
<tr>
<td>Horse Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050-130</td>
<td>Horse Serum, EIA tested (negative) serum</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F0895</td>
<td>Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E4127</td>
<td>Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Reagent</td>
<td>FisherScientific</td>
<td>BP1356-500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing neural stem cell motility using an agarose gel-based microfluidic device

マイクロ流体技術は、高分子のアッセイのために新たな成熟レベルに達している間は、細胞ベースのアッセイは、乳児の第1段階ではまだです。これは、1つは、従来の微細加工技術と材料を使用して、セルと互換性があり、安定した微小環境を作成できる難しさによるところが大きい。我々は、マイクロ流体デバイスのための基材として、新たな微細加工材料、アガロースゲルの導入を介してこの問題に対処しています。アガロースゲルは非常に可鍛性、および細胞の生存、およびそのためのセルベースアッセイのための理想的な材料のために必要なガスと栄養素の透過性です。我々は、アガロースゲルベースのデバイスは、細菌や好中球細胞遊走2を研究することに成功していることが以前に示されている。このレポートでは、つのパラレルマイクロ流体チャネルは、約1mm厚のアガロースゲル膜にパターニングされています。メディア/バッファ付き定数フローは、蠕動ポンプを使用して2つのサイドチャンネルに保持されます。細胞は、観察のためのセンターチャンネルに保持されます。サイドチャネルにおける栄養素や化学物質がサイドからセンターチャンネル、センターチャンネルの化学的環境に絶えず拡散なので簡単にサイドチャネルに沿った流れを介して制御されます。このデバイスを使用して、我々は神経幹細胞の動きは、様々な化学的条件下で容易に光学的にモニターできることを示している、との実験結果は、上皮成長因子受容体（EGFR）の過剰発現は、神経幹細胞の運動性を高めることを示している。神経幹細胞の運動性は、このように、腫瘍形成因子3細胞の攻撃性を評価するための重要なバイオマーカーです。 NSCの運動の根底にあるメカニズムを解読する神経発達の両疾患に、脳のがん幹細胞の浸潤への洞察が得られます。

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device at JoVE.com

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

我々は、上皮成長因子受容体（EGFR）の過剰発現は、小説アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞（NSC）の運動性を高めることを示している。この技術は、ヒト神経幹細胞などの細胞源が不足している他の哺乳動物細胞系、に容易に適応することができ、時間のターンアラウンドが重要です。

アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞運動の評価

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

assessing-neural-stem-cell-motility-using-an-agarose-gel-based

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K ビュー.  Cornell University. 我々は、上皮成長因子受容体（EGFR）の過剰発現は、小説アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞（NSC）の運動性を高めることを示している。この技術は、ヒト神経幹細胞などの細胞源が不足している他の哺乳動物細胞系、に容易に適応することができ、時間のターンアラウンドが重要です。

ビデオ: Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

マウス神経幹細胞の前駆体の文化

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

生物学

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

ニューロン相馬と軸索のコンパートメントのためのマイクロ流体デバイスの作製

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

ヒト神経幹細胞を数える

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

細胞生物学の勾配を生むマイクロ流体デバイス

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

マイクロ流体デバイスでコンパートメントのためのE18脳ラットのニューロンの準備

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

マイクロ流体デバイスを用いた細胞のキャプチャ

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond devices to the Corning No. 1 cover glass.  This could be due, perhaps, to a plasma cleaner not being available.  In other instances, it may be desirable to remove the device from the glass after the culturing of neurons for certain types of microscopy or for immunostaining, though it is not necessary to remove the device for immunostaining since the neurons can be stained in the device.  Some researchers, however, still prefer to remove the device.  In this case, reversible bonding of the device to the cover glass makes that possible.  There are some disadvantages to non-plasma bonding of the devices in that not as tight of a seal is formed.  In some cases axons may grow under the grooves rather than through them.  Also, because the glass and PDMS are hydrophobic, liquids do not readily enter the device making it necessary at times to force media and other reagents into the device.  Liquids will enter the device via capillary action, but it takes significantly longer as compared to devices that have been plasma bonded.  The plasma cleaner creates temporary hydrophilic charges on the glass and device that facilitate the flow of liquids through the device after bonding within seconds.  For non-plasma bound devices, liquid flow through the devices takes several minutes.  It is also important to note that the devices to be used with non-plasma bonding need to be sterilized first, whereas plasma treated devices do not need to be sterilized prior to use because the plasma cleaner will sterilize them.

In this video we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.

マイクロ流体デバイスの低コスト作製のためのPDMSの非プラズマボンディング

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond ...

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）文化

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for mesenchymal stromal cells (MSCs), fibroblasts and endothelial colony-forming cells with platelets activated by thrombin3-5 or lysed by freeze/thaw cycles6-14 before the platelet releasate is added to the cell culture medium. The trophic effect of platelet derived growth factors has already been tested in several trials for tissue engineering and regenerative therapy.1,15-17 Varying efficiency is considered to be at least in part due to individually divergent concentrations of growth factors18,19 and a current lack of standardized protocols for platelet preparation.15,16 This protocol presents a practicable procedure to generate a pool of human platelet lysate (pHPL) derived from routinely produced platelet rich plasma (PRP) of forty to fifty single blood donations. By several freeze/thaw cycles the platelet membranes are damaged and growth factors are efficiently released into the plasma. Finally, the platelet fragments are removed by centrifugation to avoid extensive aggregate formation and deplete potential antigens. The implementation of pHPL into standard culture protocols represents a promising tool for further development of cell therapeutics propagated in an animal protein-free system.

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Human platelet lysate is a rich source of growth factors and a potent supplement in cell culture. This protocol presents the process of preparing a large pool of human platelet lysate by starting from platelet rich plasma, performing several freeze-thaw cycles and depleting the platelet fragments.

動物の無血清ヒト幹細胞培養のための効率的なサプリメントとしてプールしたヒト血小板可溶化物（pHPL）の調製

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞運動の評価

アガロースゲルベースのマイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞運動の評価