ويؤيد هذا العمل من قبل مكتب ولاية نيويورك للعلوم والتكنولوجيا والبحث العلمي (NYSTAR) (في شكل مركز التكنولوجيا المتقدمة منحة) ، والمنح المقدمة من مركز النانوية (NBTC) ، وهو برنامج للمجلس الوطنى لشركة الاتصالات السعودية مؤسسة العلم تحت رقم 9876771 - ECS الاتفاق ، واستئصال ورم من الدماغ الرابطة الأمريكية وأكاديمية نيويورك للطب (JAB).

إجراء شرائح طلاء مع فبرونيكتين قبل تركيب الجهاز ميكروفلويديك ، تعقيم شرائح الزجاج مع فبرونيكتين. معطف الشرائح في biohood للحفاظ على العقم. هل محاذاة PDMS العقيمة على طول حواف الشريحة ووضع علامة على الجانب الذي يواجه حتى مع علامة دائمة. ماصة 1 مل من محلول ميكروغرام / 5 مل من فبرونيكتين (سيغما) داخل هل PDMS على كامل الشريحة الزجاجية. مغادرة الشرائح دون عائق لمدة ساعة ، ثم جافة تماما باستخدام قدرها 2 N البندقية. ويمكن تخزين الشرائح في 4 درجة مئوية في وقت لاحق لاجراء تجارب. تجميع الجهاز ويتم تجميع الجهاز بأكمله في بروتوكول biohood تحت ظروف معقمة ، وذلك باستخدام الإجراءات التالية : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف رئيسية السيليكون مع microchannels منقوشة عليها من قبل القضاء عليه مع 70 ٪ من الإيثانول والتجفيف مع مدفع 2 N. هل وضع PDMS العقيمة من ارتفاع 1 ملم باستخدام الملقط حول ميزات تخفيف الرئيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير هلام agarose المستخدمة في الجهاز عن طريق وزنها 0.3 غرام من مسحوق agarose (فيشر العلمية) و 10 مل من ثاني أكسيد الكربون 2 وسائل الإعلام المستقلة (Invitrogen) في دورق 50 مل. يحرك الخليط مع ملعقة والحرارة في الميكروويف لمدة 20 ثانية على ارتفاع. إذا حبيبات غير منحل موجودة ، حرارة المزيج لمدة 10 ثانية ودوامة الخليط الساخن للتخلص من آخر ما تبقى حبيبات. كرر هذه العملية مع الوقت التدفئة من 8 ثوان ، ومن ثم 5 ثوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل حل بسرعة agarose على سيد السيليكون محاطة هل PDMS وتغطية الخليط على الفور agarose مع شريحة زجاجية معقمة. تطبيق المستمر ، والضغط لطيف إلى الشريحة لحوالي 2 دقيقة للتأكد من أن agarose سوف هلام إلى نفس الارتفاع المستمر ملم (1) بوصفها هل PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد agarose المواد الهلامية ، انزع agarose هلام منقوشة مع PDMS هل من السيليكون الرئيسي ونقلها إلى شريحة زجاجية مغلفة مع فبرونيكتين microchannels في هلام agarose تواجه الشريحة. استخدام غيض حقنة قياس 16 لكمة ثقوب في مناطق الخزان من microchannels عن مدخل ومخرج يصل. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام المستقلة CO 2 إلى هلام agarose منقوشة على الشريحة لمنع جفاف في microchannels. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل المتعددة الاكريليك المستخدمة في الجهاز مع 70 ٪ من الإيثانول والشطف بالماء DI. محاذاة الفتحات الموجودة في مشعب مع ثقبا في agarose هلام مع microchannels. ثم ، محاذاة متعددة مع هلام ، هل PDMS ، والشريحة فبرونيكتين مع الإطار المعدني للجهاز. مكان البراغي في الجهاز وتشديد إلى نقطة المقاومة باستخدام مفك. يتم ذلك لضمان عدم الإفراط في الجهاز شددت الى حد التشويه وmicrochannels في agarose. تشديد الخناق في ترتيب عقارب الساعة للتأكد من أن جل داخل الجهاز لا تحول. اختبار الجهاز للكشف عن التسربات وانسداد في microchannels باستخدام المحاقن 1ml. يتم تركيب أنابيب المحقنة مع Tygon مع طرف ماصة هلام التحميل في نهاية الأنبوب لحقن ثاني أكسيد الكربون 2 وسائل الإعلام المستقلة في microchannels. ويعتبر الشخص متناهية شكلت بنجاح عندما لاحظ وسائل الاعلام فقط للخروج من مأخذ للمتناهية عندما يتم حقن سائل الإعلام في مدخل المناظرة. الآن ، الجهاز جاهزا للاستخدام. </li></ol> إعداد والبذر للخلايا في الجهاز عندما الخلايا تصل إلى 70 ٪ (حوالي 100،000 كثافة خلية خلية / مل) confluency ، انهم مستعدون ليكون المصنف في الجهاز. تخضع هذه الخلايا لمدة DPBS (Invitrogen) يغسل. إضافة 200 ميكرولتر من التربسين - EDTA (Invitrogen) لفصل الخلايا. نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على وسائل الإعلام 5ml M2 تحتوي على مصل لإبطال نشاط التربسين. طرد وسائل الاعلام مع نمو الخلايا في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. يستنشق قبالة طاف وresuspend الكرية من الخلايا 5 مل من DPBS. الطرد المركزي الخلايا DPBS مرة أخرى تحت نفس الظروف. يستنشق قبالة طاف مرة أخرى ، وresuspend الكرية من الخلايا في 500 ميكرولتر من CO 2 وسائل الإعلام المستقلة. التعليق البذور الناتجة من الخلايا في مركز متناهية من الجهاز عن طريق الجاذبية يحركها التدفق. إضافة مدخل ومخرج للمركز متناهية مع 60 ميكرولتر من التعليق الخلية و 20 ميكرولتر من المتوسط ​​2 - مستقلة أكسيد الكربون ، على التوالي. مركز مراقبة تحت المجهر متناهية brightfield للبحث عن التصاق الخلية. الخلايا تلتزم عادة بعد 10 دقيقة. بعد الخلايا الانضمام إلى أسفل القناة في مناطق ذات كثافة الصحيح ، pipeted خارج الخلية تعليق المتبقية في مدخل ومخرج في وسائل الاعلام. 60 ميكرولتر مكان من ثاني أكسيد الكربون 2 وسائل الإعلام المستقلة في كل من مدخل ومخرج للقناة الوسط. مكان PDMS يغطي ما يزيد على عشرةه مركز مدخل ومخرج لتقليل التبخر من وسائل الإعلام من قناة الوسط. تصوير الخلايا في الجهاز قبل تجميع الجهاز ، الصفحات الأنبوب عقيمة تمعجية من خلال محطة الطقس من المجهر (أوليمبوس X81) والتواصل مع مضخة تمعجية (واطسون ، مارلو 205U/CA). دافق من خلال برنامج تلفزيوني الأنبوب بمعدل 4 دورة في الدقيقة. بعد تجميع الجهاز وإعداد تركيزات مناسبة من عامل نمو البشرة (EGF) (سيغما) الحلول في وسائل الإعلام المستقلة 2 - CO في أنابيب الطرد المركزي 15 مل. دوامة الحلول EGF لمدة 5 ثوان والتواصل مع الأنابيب. توصيل الأنابيب التي تحمل تركيزات EGF المقابلة للجهاز. الامر يستغرق نحو ساعة لEGF لنشر عبر التلال وإنشاء قناة التدرج كيميائية ثابتة. يتم استخدام البرمجيات والتصوير ، وSlidebook ، باتخاذ مجموعة من الصور في كل 10 دقائق لحوالي 5 ساعات في تشغيل التجريبي. وتمت برمجة مرحلة XY الآلي بحيث يتم تصوير فريقين فرعيين المناطق (كل بمساحة x400μm 400μm) من قناة نفس المركز ، ومجموعه قنوات المركز الثلاثة في نقطة زمنية معينة. الخلايا في قنوات مختلفة مركز (عادة 3 في واحد تشغيل) وتركيزات مختلفة EGF ، وضعت في الأنابيب. مواد ومعدات خطوط الخلية : C17.2 NSCs الخلايا المشتقة من الطبقة الخارجية للمخيخ جرثومي الماوس بعد الولادة 6 ، 7. استخدام هذا الخط الخلية ، وضعنا اثنين آخرين من الخلايا الجذعية باستخدام خطوط الفئران الارتجاعي ترنسفكأيشن الأسلوب. هذين ستابلي transfected خطوط الخلايا هي : (1) wtEGFR -- أن الإفراط في الإنسان تعرب عن EGFR نوع البرية ، و (2) ΔEGFR -- التي هي متحولة EGFR constitutively النشطة. لسهولة الكشف والفيروسات القهقرية تحمل العمود الفقري مع الجين المصالح يعقبه موقع الداخلية للربط الريباسي (IRES) والبروتين الفلوري الأخضر (GFP). خلية ثقافة : كانت تزرع الماوس C17.2 NSCs والمتغيرات في لوحة 6 - M2 جيدا في وسائل الإعلام (DMEM (Invitrogen) مع 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) (Invitrogen) ، و 5 ٪ مصل الحصان (HS) (Invitrogen ) ، و 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين (Invitrogen)) واستمرت الخلايا في درجة مئوية و 37 في الهواء بنسبة 80 ٪ و 5 ٪ CO 2. ميكروفلويديك الجهاز : مشعب بلاستيكية وهل PDMS ، والإطار الذي لا يصدأ لعقد الجهاز في مكانه. التصوير ويستخدم مجهر مقلوب فلوري (أوليمبوس IX - 81) ، في اتصال مع كاميرا CCD المكثف (أوركا ، هاماماتسو). هي التي شنت على الجهاز ميكروفلويديك مرحلة XYZ الآلي ، ويتم تضمينه في المرحلة قبل الغرفة البيئية التي تحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية. عادة ما تكون هناك أجهزة 3-4 على الشريحة نفسها التي سيتم تصويره في الوقت نفسه باستخدام نقطة مرحلة XYZ الآلي. الحفاظ على التدفق ويستخدم مضخة تمعجية مع 8 خطوط متوازية (واطسون ، مارلو 205U/CA) للحفاظ على تدفق السيارات في جميع المصارف وقنوات المصدر. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_6/674_Figure-01.jpg" alt="الشكل 1" width="573" height="414" /> التين. 1 سلالات NSC على الحركة الثلاثة (الوالدين ، wtEGFR وEGFR D) في تركيزات مختلفة EGF تؤخذ جميع المسارات من تعقب فيلم من 5 ساعات (باستثناء wtEGF 100ng/ml ، 4hour) ، وكان منشأ جميع المسارات تعديل أوضاعها في (0،0) لغرض المقارنة. <img src="/files/ftp_upload/old/674_2008_9_29_7/674_Figure-02.jpg" alt="الشكل 2" width="576" height="546" /> التين. 2 العددية بين مستوى التعبير والحركة EGFR (أ) صورتين من NSCs wtEGF على سطح قناة ميكروفلويديك مع EGF 100ng/ml. الصورة اليسرى هي صورة الفلورسنت ، والحق هو حقل الصورة المنقولة مشرق. شريط المقياس 100μm ، و قناة العرض هو 400 ميكرون. يتم فصل الخلايا في اثنين من السكان من قبل سطوع GFP التي أعرب عنها. الخلايا في الدوائر الزرقاء هي باهتة ، وبالتالي أقل EGFR مستوى التعبير ، والخلايا في الدوائر الحمراء هي brigher ، وبذلك أعلى مستوى التعبير EGFR. (ب) من الخلايا التي تحتوي على مسارات المنخفضة والعالية المستوى EGFR التعبير. وتتخذ هذه المسارات من فيلم مدته ساعة الأربعة.

<ol>
	<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+in+search+of+a+killer+application.">Microfluidics: in search of a killer application.</a> Nature Methods. 4, 665-670 (2007).</li><li>Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. a. x., Archer, S. h. i. v. a. u. n., Shuler, M. i. c. h. a. e. l. . L., Wu, M. i. n. g. m. i. n. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hydrogel-based+microfluidic+device+for+the+studies+of+directed+cell+migration.">A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration.</a> Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).</li><li>Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+naturally+occurring+constitutively+active+variant+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+mouse+fibroblasts+increases+motility.">Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility.</a> Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).</li><li>Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+duality+of+EGFR+signaling+and+neural+stem+cell+phenotype:+Cell+enhancer+or+cell+transformer.">The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer.</a> Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).</li><li>Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repellents+for+Escherichia+coli+operate+neither+by+changing+membrane+fluidity+nor+by+being+sensed+by+periplasmic+receptors+during+chemotaxis.">Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis.</a> J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).</li><li>Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+cell+lines+can+engraft+and+participate+in+development+of+mouse+cerebellum.">Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum.</a> Cell. 68, 33-51 (1992).</li><li>Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+neural+precursors+can+differentiate+toward+replacement+of+neurons+undergoing+targeted+apoptotic+degeneration+in+adult+mouse+neocortex.">Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).</li></ol>

التين. 1 يبين مسارات سلالات NSC الثلاثة ، الخلايا الأبوية ، وwtEGFR وΔEGFR على (السيطرة). تم الحصول على كل مجموعة من المسارات من الفيلم 5 ساعات طويلة. لخلايا الوالدين ، بلغت ذروتها عندما خلية حركية EGF كان تركيز ~ 10ng/ml ؛ wtEGFR للخلايا ، خلية حركية تحولت إلى ذروة 100ng/ml أو أعلاه ؛ ΔEGFR للخلايا ، وا?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11971-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CO2-independent media</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18045-088</td>
<td>A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine</td>
</tr>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25200-072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline</td>
</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10437-028</td>
<td>Fetal Bovine Serum, Qualified</td>
</tr>
<tr>
<td>Horse Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16050-130</td>
<td>Horse Serum, EIA tested (negative) serum</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F0895</td>
<td>Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin</td>
</tr>
<tr>
<td>EGF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E4127</td>
<td>Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized</td>
</tr>
<tr>
<td>Agarose</td>
<td>Reagent</td>
<td>FisherScientific</td>
<td>BP1356-500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

assessing neural stem cell motility using an agarose gel-based microfluidic device

في حين أن تكنولوجيا ميكروفلويديك هو التوصل إلى مستوى جديد من النضج لفحوصات الجزيئات ، خلية مقرها المقايسات لا تزال في مرحلة الرضع 1. هذا هو إلى حد كبير بسبب الصعوبة التي يمكن للمرء أن إنشاء خلية المكروية متوافق مع وثابتة باستخدام تقنيات التصنيع الدقيق والمواد التقليدية. علينا معالجة هذه المشكلة عن طريق ادخال مادة التصنيع الدقيق الرواية ، agarose هلام ، والمادة الأساسية للجهاز ميكروفلويديك. Agarose هلام هو طيع للغاية ، ونفاذا إلى الغاز والمواد المغذية الضرورية لبقاء الخلية ، وبالتالي مادة مثالية لخلية مقرها المقايسات. لقد أظهرنا سابقا أن الأجهزة agarose هلام تستند نجحت في دراسة جرثومية والعدلة الهجرة الخلية 2. في هذا التقرير ، هي منقوشة ثلاث قنوات ميكروفلويديك موازية في الغشاء agarose هلام سمك 1MM تقريبا. تتم المحافظة على تدفقات مستمرة مع وسائل الاعلام / العازلة في القنوات الجانبين باستخدام مضخة تمعجية. تتم المحافظة على الخلايا في قناة مركز للمراقبة. منذ المغذيات والمواد الكيميائية في القنوات الجانبية نشرها باستمرار من جانب إلى مركز القناة ، والبيئة الكيميائية للقناة المركز هو السيطرة عليها بسهولة عن طريق تدفق على طول قنوات جانبية. باستخدام هذا الجهاز ، ونحن إثبات أنه يمكن رصد حركة الخلايا الجذعية العصبية بصريا مع سهولة في ظل الظروف الكيميائية المختلفة ، والنتائج التجريبية تبين أن أكثر من التعبير البشرة مستقبلات عامل النمو (EGFR) يعزز من القدرة على الحركة من الخلايا الجذعية العصبية. حركية من خلايا الجذعية العصبية هي العلامات البيولوجية الهامة لتقييم الخلايا العدوانية ، وبالتالي عامل مكون للأورام 3. سوف فك رموز آلية حركية الغلة الكامنة NSC نظرة ثاقبة على حد سواء الاضطرابات العصبية والتنمية في سرطان الدماغ الجذعية غزو الخلايا.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device at JoVE.com

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

علينا أن نظهر أن التعبير أكثر من البشرة مستقبلات عامل النمو (EGFR) يعزز حركية من خلايا الجذعية العصبية (NSCs) باستخدام agarose هلام رواية الجهاز ميكروفلويديك القائمة. يمكن أن تكون قابلة للتكيف هذه التكنولوجيا بسهولة لغيرها من نظم خلايا الثدييات الخلية حيث قالت مصادر شحيحة ، مثل الخلايا الجذعية العصبية ، وبدوره حولها الساعة الحرجة.

تقييم العصبية على الحركة باستخدام الخلايا الجذعية جل المستندة Agarose الأجهزة ميكروفلويديك

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

assessing-neural-stem-cell-motility-using-an-agarose-gel-based

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  Cornell University. علينا أن نظهر أن التعبير أكثر من البشرة مستقبلات عامل النمو (EGFR) يعزز حركية من خلايا الجذعية العصبية (NSCs) باستخدام agarose هلام رواية الجهاز ميكروفلويديك القائمة. يمكن أن تكون قابلة للتكيف هذه التكنولوجيا بسهولة لغيرها من نظم خلايا الثدييات الخلية حيث قالت مصادر شح?...

Video: Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

ثقافة العصبية الماوس السلائف الخلايا الجذعية

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

تصنيع جهاز ميكروفلويديك للتجزئة سوما الخلية العصبية والمحاوير

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Counting Human Neural Stem Cells

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as plating cells for immunocytochemistry or for cell transfections. This protocol describes a straightforward and fast method for differentiating between live and dead cells and quantifying the cell concentration and total cell number using a hemacytometer. This procedure first requires detaching cells from a growth surface and resuspending them in media. Next, the cells are diluted in a solution of Trypan blue (ideally to a concentration that will give 20-50 cells per quadrant) and placed in the hemacytometer. Finally, averaging the counts of viable cells in several randomly selected quadrants, dividing the average by the volume of one 1 mm2 quadrant (0.1 &mu;l) and multiplying by the dilution factor gives the number of cells per l. Multiplying this cell concentration by the total volume in &mu;l gives the total cell number. This protocol describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can also be used for many other cell types.

Knowledge of the exact number of viable cells is required for many tissue culture manipulations. This protocol describes how to differentiate between live and dead cells and quantify cells using a hemacytometer. Although it describes counting human neural stem/precursor cells (hNSPCs), it can be used for other cell types.

عد الخلايا الجذعية العصبية البشرية

Knowledge of the exact number of viable cells in a given volume of a cell suspension is required for many routine tissue culture manipulations, such as ...

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

الركض الخلايا الجذعية العصبية البشرية

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest, most commonly a protein, in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable researchers to conserve primary and secondary antibodies while getting high quality, reproducible qualitative and quantitative data out of their staining. There are two aspects of this protocol that help to conserve the volume of antibody necessary for staining. For one, the cells are grown on small, circular coverslips that are placed in wells of a tissue culture plate. After fixation, the cells on coverslips can be removed from the wells of the plate. For antibody staining, the coverslip with cells is inverted onto a small drop of antibody solution on parafilm and is covered with a second piece of parafilm to prevent drying. Using this method, only ~25 &mu;l of antibody solution is needed for each coverslip (or sample) to be stained. This protocol describes immunostaining of human neural stem/precursor cells (hNSPCs), but can be used for many other cell types.

Immunocytochemistry is a powerful method to determine the presence, subcellular localization, and relative abundance of an antigen of interest in cultured cells. This protocol presents an easy-to-follow series of steps that will enable one to conserve antibodies and get the most out of one's staining.

كيمياء سيتولوجية مناعية : الخلايا الجذعية العصبية البشرية

Immunocytochemistry is a very powerful and fairly straightforward method for determining the presence, subcellular localization, and relative abundance of ...

A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

جهاز ميكروفلويديك مع أنماط Groove لدراسة السلوك الخليوي

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

جهاز لتوليد التدرج ميكروفلويديك لبيولوجيا الخلية

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

إعداد E18 العصبونات القشرية للتجزئة الجرذ في جهاز ميكروفلويديك

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

القبض على خلية باستخدام جهاز ميكروفلويديك

Non-plasma Bonding of PDMS for Inexpensive Fabrication of Microfluidic Devices

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond devices to the Corning No. 1 cover glass.  This could be due, perhaps, to a plasma cleaner not being available.  In other instances, it may be desirable to remove the device from the glass after the culturing of neurons for certain types of microscopy or for immunostaining, though it is not necessary to remove the device for immunostaining since the neurons can be stained in the device.  Some researchers, however, still prefer to remove the device.  In this case, reversible bonding of the device to the cover glass makes that possible.  There are some disadvantages to non-plasma bonding of the devices in that not as tight of a seal is formed.  In some cases axons may grow under the grooves rather than through them.  Also, because the glass and PDMS are hydrophobic, liquids do not readily enter the device making it necessary at times to force media and other reagents into the device.  Liquids will enter the device via capillary action, but it takes significantly longer as compared to devices that have been plasma bonded.  The plasma cleaner creates temporary hydrophilic charges on the glass and device that facilitate the flow of liquids through the device after bonding within seconds.  For non-plasma bound devices, liquid flow through the devices takes several minutes.  It is also important to note that the devices to be used with non-plasma bonding need to be sterilized first, whereas plasma treated devices do not need to be sterilized prior to use because the plasma cleaner will sterilize them.

In this video we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.

غير البلازما من الربط PDMS للصناعات رخيصة من أجهزة ميكروفلويديك

In this video, we demonstrate how to use the neuron microfluidic device without plasma bonding.  In some cases it may be desirable to reversibly bond ...