L&#39;assistance Andrew Lang dans la représentation graphique des données est appréciée. Merci à Mettler-Toledo pour fournir des équipements et matériels pour mener à bien les travaux expérimentaux.

Présentation La réaction Ugi s&#39;est révélée être un moyen pratique pour créer rapidement des bibliothèques de composés diversifiés (1-3). Elle implique la réaction d&#39;une amine, un aldéhyde, un acide carboxylique et un isonitrile généralement dans le méthanol à température ambiante. La réaction de Ugi a souvent été utilisé comme un outil dans la synthèse de molécules pharmacologiquement actives et nous l&#39;ont exploitée pour accéder rapidement à des composés dans la recherche de nouveaux agents anti-paludisme (4). Il a été observé que les produits Ugi parfois précipiter dans sa forme pure du mélange réactionnel (1,5). C&#39;est un résultat très chanceux, car la réaction peut alors être facilement étendue sans nécessitant des procédures de purification coûteuses telles que la chromatographie. Il serait plus bénéfique pour optimiser le rendement du produit Ugi obtenue directement à partir de filtration du mélange réactionnel sans autre traitement. À cette fin, nous avons utilisé une fente de 48 Mettler-Toledo MiniBlock (6) équipée de tubes de filtration. Un Mettler-Toledo MiniMapper (7) gestionnaire automatisé liquide a été utilisé pour fournir les réactifs et les solvants. Les paramètres d&#39;intérêt ont été la concentration, la composition du solvant et l&#39;excès de certains des réactifs. Expérimentale Le gestionnaire automatisé MiniMapper liquide a été programmé pour délivrer des liquides dans la séquence suivante pour vider des tubes de filtre dans un MiniBlock 48 position: solvant supplémentaire, furfurylamine (2M dans le méthanol), le benzaldéhyde (2M dans le méthanol), Boc-glycine (2M dans le méthanol) et t-butylisocyanide (2M dans le méthanol). Le volume par défaut a été plus de 100 microlitres. Si un réactif est noté comme étant ajouté en excès, 120 microlitres ont été livrés. Le MiniBlock a ensuite été placé sur un agitateur pendant 16 heures avant d&#39;être filtrée en utilisant un vide maison. Deux lavages sont effectués par l&#39;ajout de méthanol (1 ml) dans chaque tube, suivies de 15 min en secouant avant de filtrer. Les tubes ont été ensuite séchées sous vide poussé dans un dessiccateur pendant au moins 30 min. Le rendement est calculé à partir de l&#39;augmentation du poids des tubes de filtre. La pureté a été évaluée par RMN pour un échantillon de chaque système de solvant et la concentration. Les réactions ont été effectués en triple (8-10) et les rendements moyens sont présentés au tableau 1. Caractérisation du produit Ugi <a href="http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.21106059.html">tert-butyle (2 - {[2 - (tert-butylamino)-2-oxo-1-phényléthyl] (furane-2-ylméthyl) amino}-2-oxoéthyl) carbamate</a> : solide blanc; PF (11) 202-204 C; RMN 1H (12, <a href="http://showme.physics.drexel.edu/mirza/Software/JCAMP/Exp203A11-HNMR.html">spectre</a> ) (500MHz, δppm, CDCI3) 1,33 (s, 9H), 1,45 (s, 9H), 4,21 (m, 2H), 4,49 (d, J = 18Hz, 1H), 4,50 ( d, J = 18Hz, 1H), 5,47 (s, 1H), 5,60 (s, 1H), 5,62 (s, 1H), 5,89 (s, 1H), 6,10 (s, 1H), 7,19 (s, 1H) , phényle de 7,21 à 7,37 (m, 5H); 13C (13, <a href="http://showme.physics.drexel.edu/mirza/Software/JCAMP/Exp02060822080933CNMR.html">spectre</a> ) (500MHz, δppm, CDCI3) 28,3, 28,6, 42,3, 42,8, 51,7, 62,9, 79,5, 107,7, 110,4, 128,5, 128,7, 129,6, 134,7 , 141.9, 149.8, 155.7, 168.4 170.2; IR (14, <a href="http://showme.physics.drexel.edu/mirza/Software/JCAMP/ugiproductpaper03IR.html">spectre</a> ) (Ʋmax cm-1 ATR): 1645,1673,1699, 3331; FAB-HRMS (15, <a href="http://showme.physics.drexel.edu/mirza/Exp099Chighres.JPG">spectre</a> ) (calculé pour C24H33N3O5 m / z 444.2498 [M + H], a obtenu 444.2517). Analyse des données Les données sur le rendement précipité est analysé en utilisant le facteur unique ou à deux facteurs (avec répétitions) une analyse de variance (Anova) des outils disponibles dans Microsoft Excel. (16) Pour ces variables avérées statistiquement significative dans l&#39;analyse de variance, plus petite différence significative de Fisher (LSD) a été utilisé pour déterminer les paramètres expérimentaux spécifiques présentant des différences significatives dans le rendement du précipité Ugi (17). Tous les tests de signification ont été effectuées au niveau de confiance de 95%. Résultats et discussion La figure 1 résume l&#39;effet de la composition du solvant sur le rendement du précipité Ugi. Un seul facteur ANOVA indique une différence significative dans les taux de rendement moyen pour les quatre solvants étudiés à une concentration de 0,2 M réactif. Test LSD de Fisher indique que les rendements précipité obtenu dans le méthanol et l&#39;éthanol ne sont pas statistiquement différents au niveau de confiance 95% (signifié par la barre sur les noms de solvants dans la figure), le rendement de précipité Ugi est significativement plus grande dans l&#39;éthanol et le méthanol que dans l&#39;acétonitrile, qui à son tour est significativement supérieure à celle dans le THF. <img src="/files/ftp_upload/old/942_2008_9_26_0/942_Figure-01.png" alt="Figure 1" /> Figure 1: Résumé de l&#39;effet de la composition du solvant sur ​​le rendement de l&#39;Ugi précipité à une Reagela concentration de 0,2 M NT. Les solvants énumérés comprennent le methanol 40% à cette concentration. Considérant l&#39;effet de la concentration des réactifs, les données du tableau 1 montrent une chute précipitée du rendement a été trouvé lors du passage de 0,2 à 0,07 M en utilisant le méthanol, l&#39;éthanol et l&#39;acétonitrile comme solvant; les rendements ont été comparables dans le méthanol à l&#39;0,2 et 0,4 Les concentrations M. Notez que les réactions de Ugi sont généralement exécutés dans la gamme 0.5-2M (2). Toutefois, lorsque vous utilisez un gestionnaire automatisé de liquide, il peut être difficile de commencer avec des solutions de réactifs beaucoup plus concentrée que 2M, plaçant ainsi une limite supérieure pratique de la concentration finale d&#39;environ 0,5 M. Les résultats de cette étude d&#39;optimisation incitent à la prudence dans l&#39;interprétation de la réussite ou l&#39;échec des réactions de Ugi-dessous 0.2M, puisque les effets non linéaires sont apparemment à jouer. La figure 2 résume l&#39;effet de la composition du solvant et l&#39;excès de réactif sur le rendement de précipité Ugi à une concentration de 0,2 M réactif. Les résultats ANOVA à deux facteurs indiquent un solvant statistiquement significative et l&#39;effet excès de réactif. En outre, il existe une interaction significative entre les deux variables. Détails de l&#39;interaction sont découverts dans la figure 2 qui montre que le rendement de précipité est affectée par le solvant utilisé. Encore une fois noter que les barres sur les facteurs de la figure indiquent les rendements ne sont pas statistiquement différents au niveau de confiance de 95%. Pour l&#39;éthanol et le méthanol les meilleurs rendements sont obtenus avec l&#39;imine ou isonitrile en excès, tandis que pour l&#39;acétonitrile, des résultats significativement améliorés sont obtenus avec l&#39;amine, aldéhyde ou isonitrile en excès. Comme indiqué plus haut dans la discussion sur les résultats dans le tableau 1, le rendement global de précipité est faible pour le THF comme solvant, et seulement un excès d&#39;imine conduit à une amélioration statistiquement significative dans le rendement précipité. Ces différents modes d&#39;amélioration du rendement pour les quatre solvants est ce qui conduit à l&#39;effet d&#39;interaction statistiquement significative, et peut être un indicateur de l&#39;interaction différente du produit Ugi avec les solvants différents. Bien que les résultats numériques dans le tableau 1 montrent le meilleur rendement a été obtenu dans le méthanol 0,4 M avec 1,2 équivalents d&#39;imine excès, l&#39;acétonitrile 0,2 / méthanol et 0,2 M d&#39;éthanol / méthanol a également fourni des rendements significatifs. Notez en particulier que tous les mélanges THF / méthanol à 0,2 M a donné des résultats très médiocres. La réaction de Ugi a été effectué avec succès dans une variété de solvants, y compris le THF (2). Notez que les faibles rendements ici ne signifie pas que la réaction de Ugi n&#39;a pas eu lieu dans les mélanges THF, seuls un précipité n&#39;a pas été formé. <img src="/files/ftp_upload/old/942_2008_10_13_5/942_Figure-02.png" alt="Figure 2" width="335" height="325" /> Figure 2: Résumé de l&#39;effet de la composition de solvant et l&#39;excès de réactif sur le rendement de l&#39;Ugi précipité à une concentration de 0,2 M réactif. Les solvants énumérés comprennent le methanol 40% à cette concentration. La figure 3 résume l&#39;effet de la concentration des réactifs et plus réactif sur le rendement de l&#39;Ugi précipitent en utilisant du méthanol comme solvant. Les résultats ANOVA à deux facteurs indiquent une concentration significative et l&#39;effet excès de réactif. Comme décrit ci-dessus, le rendement de précipité à des concentrations de réactifs de 0,2 M et 0,4 M sont significativement supérieures à 0,07 M à (mais ne diffèrent pas les uns des autres). En outre, il existe une interaction significative entre les deux variables à l&#39;étude. Notez que le motif de l&#39;amélioration du rendement précipité avec l&#39;identité de l&#39;excès de réactif est généralement le même pour les concentrations de réactifs plus élevé. <img src="/files/ftp_upload/old/942_2008_9_26_2/942_Figure-03.png" alt="Figure 3" width="384" height="255" /> Figure 3: Résumé de l&#39;effet de la concentration et l&#39;excès de réactif sur le rendement de l&#39;Ugi précipité dans le méthanol solvant. Globalement, les résultats décrits dans les figures 2 et 3 démontrent qu&#39;il y avait des interactions entre la concentration de réactifs choix du solvant, et l&#39;identité du réactif en excès, mais dans l&#39;ensemble ce sont plus subtiles que les effets droites solvant et la concentration. D&#39;autres ont trouvé des résultats similaires lors de l&#39;optimisation d&#39;une réaction de Ugi (18). Conclusion L&#39;expérience d&#39;optimisation trouvé le rendement le plus élevé des 48 fonctionne à 66%, passant de 0,4 M avec du méthanol 1,2 éq. d&#39;imine. Ce chiffre est nettement supérieur au rendement de 49% obtenu à partir de la réaction initiale en vertu de concentration équimolaire à 0,4 M dans le méthanol. Bonne reproductibilité des rendements précipité est obtenu dans ces expériences répétées, permettant des effets d&#39;interaction subtile pour être positivement identifié.

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	<li>Marcaccini, S., Torroba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+Ugi+four-component+condensation.">The use of the Ugi four-component condensation.</a> Nature Protocols. 2, 632-63 (2007).</li><li>Domling, A., Ugi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicomponent+reactions+with+isocyanides+Angew.">Multicomponent reactions with isocyanides Angew.</a> Chem. Int. Eng. Ed. 39, 3168-31 (2000).</li><li>Domling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Developments+in+Isocyanide+Based+Multi-Component+Reactions+in.">Recent Developments in Isocyanide Based Multi-Component Reactions in.</a> Applied Chemistry, Chem. Rev.. 106, (2006).</li><li>Bradley, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> http://usefulchem.blogspot.com/2008/01/we-have-anti-malarial-activity.html. , .</li><li>Sanudo, M., Marcaccini, M., Basurto, S., Torroba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+3-Hydroxy-6-oxo[1,2,4]triazin-1-yl+Alaninamides,+a+New+Class+of+Cyclic+Dipeptidyl.">Synthesis of 3-Hydroxy-6-oxo[1,2,4]triazin-1-yl Alaninamides, a New Class of Cyclic Dipeptidyl.</a> Ureas J. Org. Chem.. 71, 4578-45 (2006).</li><li>Bradley, J. -. C., Mirza, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> UsefulChem EXP201 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP201. , .</li><li>Bradley, J. -. C., Mirza, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EXP202 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP202. , .</li><li>Bradley, J. -. C., Mirza, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EXP203 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP203. , .</li><li>p, m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> from compound UC-099C from EXP099 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP099. , .</li><li>Bradley, J. -. C., NMR, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> spectrum 203A11 from UsefulChem EXP203 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP203. , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C NMR spectrum 206A from UsefulChem EXP206 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP206. , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IR spectrum from compound UC-099C from EXP099 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP099. , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> FAB-MS from compound UC-099C from EXP099 http://usefulchem.wikispaces.com/EXP099. , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Analysis details available at http://usefulchem.wikispaces.com/space/showimage/EXP201-203_KO-A.xls. , .</li><li>Montgomery, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Analysis+of+Experiments.">Design and Analysis of Experiments.</a> Nature Protocols. , (2005).</li><li>Tye, H., Whittaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+Design+of+Experiments+approach+for+the+optimisation+of+a+microwave+assisted+Ugi+reaction.">Use of a Design of Experiments approach for the optimisation of a microwave assisted Ugi reaction.</a> Org. Biomol. Chem.. 2, 813-813 (2004).</li></ol>

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Furfurylamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F20009</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Benzaldehyde</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>12010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Boc-glycine</td>
<td>Reagent</td>
<td>TCI America</td>
<td>B1185</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>t-butylisocyanide</td>
<td>Reagent</td>
<td>TCI America</td>
<td>B1274</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optimization of the ugi reaction using parallel synthesis and automated liquid handling

L&#39;optimisation d&#39;une réaction de Ugi impliquant le mélange des furfurylamine, benzaldéhyde, BOC-glycine et t-butylisocyanide est décrite. Triplicate fonctionne de 48 expériences parallèles sont signalés, allant de concentration, solvant et l&#39;excès de certains des réactifs. L&#39;isolement du produit a été obtenu par une simple filtration et la procédure de lavage. Le plus haut rendement obtenu est de 66%, passant de 0,4 M avec du méthanol 1,2 éq. d&#39;imine. Ce chiffre est nettement supérieur au rendement de 49% obtenu à partir de la réaction initiale en vertu de concentration équimolaire à 0,4 M dans le méthanol. Des solutions de méthanol avec des concentrations de réactifs de 0,4 M 0,2 M ou ont donné des rendements supérieurs alors que tous les systèmes de solvant à 0,07 M de mauvais résultats. À 0,2 M mélanges, le méthanol et l&#39;éthanol / méthanol (60/40) étaient statistiquement tout aussi bons THF / méthanol (60/40) était pauvre et de l&#39;acétonitrile / méthanol (60/40) était intermédiaire. Bonne reproductibilité des rendements précipité est obtenu dans ces expériences répétées, permettant des effets d&#39;interaction subtile pour être positivement identifié.

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Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

La réaction Ugi s&#39;est révélée être un moyen pratique pour créer rapidement des bibliothèques de composés diversifiés. Elle implique la réaction d&#39;une amine, un aldéhyde, un acide carboxylique et un isonitrile généralement dans le méthanol à température ambiante. Dans cette vidéo, nous utilisons un 48 slot Mettler-Toledo MiniBlock équipés de tubes de filtration et un gestionnaire de Mettler-Toledo MiniMapper liquide automatisé a été utilisé pour fournir les réactifs et les solvants. Les paramètres d&#39;intérêt ont été la concentration, la composition du solvant et l&#39;excès de certains des réactifs.

Optimisation de la réaction de Ugi utilisant la synthèse parallèle et automatisé de manipulation des liquides

The optimization of a Ugi reaction involving the mixing of furfurylamine, benzaldehyde, boc-glycine and t-butylisocyanide is described.  Triplicate runs ...

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Research

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Biology

16.2K vues.  Drexel University. La réaction Ugi s'est révélée être un moyen pratique pour créer rapidement des bibliothèques de composés diversifiés. Elle implique la réaction d'une amine, un aldéhyde, un acide carboxylique et un isonitrile généralement dans le méthanol à température ambiante. Dans cette vidéo, nous utilisons un 48 slot Mettler-Toledo MiniBlock équipés de tubes de filtration et un gestionnaire de Mettler-Toledo MiniMapper liquide automatisé a été utilisé p...

Vidéo: Optimization of the Ugi Reaction Using Parallel Synthesis and Automated Liquid Handling

Semi-automated Optical Heartbeat Analysis of Small Hearts

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our Semi-automatic Optical Heartbeat Analysis (SOHA) uses a novel movement detection algorithm that is able to detect cardiac movements associated with individual contractile and relaxation events. The program provides a host of physiologically relevant readouts including systolic and diastolic intervals, heart rate, as well as qualitative and quantitative measures of heartbeat arrhythmicity. The program also calculates heart diameter measurements during both diastole and systole from which fractional shortening and fractional area changes are calculated. Output is provided as a digital file compatible with most spreadsheet programs. Measurements are made for every heartbeat in a record increasing the statistical power of the output. We demonstrate each of the steps where user input is required and show the application of our methodology to the analysis of heart function in all three genetically tractable heart models.

We have developed a Semi-automated Optical Heartbeat Analysis method (SOHA) for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts. We demonstrate the application of our methodology to the analysis of heart function in fruit fly and embryonic mouse hearts.

Analyse semi-automatisée Heartbeat optique de petits coeurs

We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Recherche

Biologie

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utiliser le système de fractionnement GELFREE 8100 pour les Poids Moléculaire à base de fractionnement avec récupération de la phase liquide

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of microbiology was transformed with the advent of Anton van Leeuwenhoek&#39;s microscope, which allowed scientists to visualize prokaryotes for the first time. The development of the polymerase chain reaction (PCR) is one of those innovations that changed the course of molecular science with its impact spanning countless subdisciplines in biology. The theoretical process was outlined by Keppe and coworkers in 1971; however, it was another 14 years until the complete PCR procedure was described and experimentally applied by Kary Mullis while at Cetus Corporation in 1985. Automation and refinement of this technique progressed with the introduction of a thermal stable DNA polymerase from the bacterium Thermus aquaticus, consequently the name Taq DNA polymerase.
PCR is a powerful amplification technique that can generate an ample supply of a specific segment of DNA (i.e., an amplicon) from only a small amount of starting material (i.e., DNA template or target sequence). While straightforward and generally trouble-free, there are pitfalls that complicate the reaction producing spurious results. When PCR fails it can lead to many non-specific DNA products of varying sizes that appear as a ladder or smear of bands on agarose gels. Sometimes no products form at all. Another potential problem occurs when mutations are unintentionally introduced in the amplicons, resulting in a heterogeneous population of PCR products. PCR failures can become frustrating unless patience and careful troubleshooting are employed to sort out and solve the problem(s). This protocol outlines the basic principles of PCR, provides a methodology that will result in amplification of most target sequences, and presents strategies for optimizing a reaction. By following this PCR guide, students should be able to: 
 
&#9679; Set up reactions and thermal cycling conditions for a conventional PCR experiment 
&#9679; Understand the function of various reaction components and their overall effect on a PCR experiment 
&#9679; Design and optimize a PCR experiment for any DNA template 
&#9679; Troubleshoot failed PCR experiments

PCR has emerged as a common technique in many molecular biology laboratories. Provided here is a quick guide to several conventional PCR protocols. Because each reaction is a unique experiment, optimal conditions required to generate a product vary. Understanding the variables in a reaction will greatly enhance troubleshooting efficiency, thereby increasing the chance to obtain the desired result.

Polymerase Chain Reaction: Protocole Basic Plus Stratégies de dépannage et d&#39;optimisation

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Spatial Multiobjective Optimization of Agricultural Conservation Practices using a SWAT Model and an Evolutionary Algorithm

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals across the landscape is of primary importance in watershed management. Traditional economics methods of finding the lowest-cost solution in the watershed context (e.g.,5,12,20) assume that off-site impacts can be accurately described as a proportion of on-site pollution generated. Such approaches are unlikely to be representative of the actual pollution process in a watershed, where the impacts of polluting sources are often determined by complex biophysical processes. The use of modern physically-based, spatially distributed hydrologic simulation models allows for a greater degree of realism in terms of process representation but requires a development of a simulation-optimization framework where the model becomes an integral part of optimization.
Evolutionary algorithms appear to be a particularly useful optimization tool, able to deal with the combinatorial nature of a watershed simulation-optimization problem and allowing the use of the full water quality model. Evolutionary algorithms treat a particular spatial allocation of conservation practices in a watershed as a candidate solution and utilize sets (populations) of candidate solutions iteratively applying stochastic operators of selection, recombination, and mutation to find improvements with respect to the optimization objectives. The optimization objectives in this case are to minimize nonpoint-source pollution in the watershed, simultaneously minimizing the cost of conservation practices. A recent and expanding set of research is attempting to use similar methods and integrates water quality models with broadly defined evolutionary optimization methods3,4,9,10,13-15,17-19,22,23,25. In this application, we demonstrate a program which follows Rabotyagov et al.'s approach and integrates a modern and commonly used SWAT water quality model7 with a multiobjective evolutionary algorithm SPEA226, and user-specified set of conservation practices and their costs to search for the complete tradeoff frontiers between costs of conservation practices and user-specified water quality objectives. The frontiers quantify the tradeoffs faced by the watershed managers by presenting the full range of costs associated with various water quality improvement goals. The program allows for a selection of watershed configurations achieving specified water quality improvement goals and a production of maps of optimized placement of conservation practices.

This work demonstrates an integration of a water quality model with an optimization component utilizing evolutionary algorithms to solve for optimal (lowest-cost) placement of agricultural conservation practices for a specified set of water quality improvement objectives. The solutions are generated using a multi-objective approach, allowing for explicit quantification of tradeoffs.

Optimisation multiobjectif spatiale des pratiques agricoles de conservation en utilisant un modèle SWAT et un algorithme évolutionnaire

Finding the cost-efficient (i.e., lowest-cost) ways of targeting conservation practice investments for the achievement of specific water quality goals ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Culture de cellules humaines épithéliales nasales à l&#39;interface Air Liquide

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Automated Quantification and Analysis of Cell Counting Procedures Using ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis algorithms which can be used effectively to count various biological particles. When counting large numbers of cell samples, the hemocytometer presents a bottleneck with regards to time. Likewise, counting membranes from migration/invasion assays with the ImageJ plugin Cell Counter, although accurate, is exceptionally labor intensive, subjective, and infamous for causing wrist pain. To address this need, we developed two plugins within ImageJ for the sole task of automated hemocytometer (or known volume) and migration/invasion cell counting. Both plugins rely on the ability to acquire high quality micrographs with minimal background. They are easy to use and optimized for quick counting and analysis of large sample sizes with built-in analysis tools to help calibration of counts. By combining the core principles of Cell Counter with an automated counting algorithm and post-counting analysis, this greatly increases the ease with which migration assays can be processed without any loss of accuracy.

This paper describes the quantification of hemocytometer and migration/invasion micrographs through two new open-source ImageJ plugins Cell Concentration Calculator and migration assay Counter. Furthermore, it describes image acquisition and calibration protocols as well as discusses in detail the input requirements of the plugins.

Automated Quantification et analyse des procédures de comptage cellulaire Utilisation ImageJ Plugins

The National Institute of Health&#39;s ImageJ is a powerful, freely available image processing software suite. ImageJ has comprehensive particle analysis ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

Procédure et des stratégies d’optimisation clés pour un procédé de dosage immunologique axée sur électrophorèse capillaire automatisée

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid acquisition require assessing mouthpart structure and function relationships; however, fluid uptake mechanisms are historically inferred from observations of structural architecture, sometimes unaccompanied with experimental evidence. Here, we report a novel method for assessing fluid-uptake abilities with butterflies (Lepidoptera) and flies (Diptera) using small amounts of liquids. Insects are fed with a 20% sucrose solution mixed with fluorescent, magnetic nanoparticles from filter papers of specific pore sizes. The crop (internal structure used for storing fluids) is removed from the insect and placed on a confocal microscope. A magnet is waved by the crop to determine the presence of nanoparticles, which indicate if the insects are able to ingest fluids. This methodology is used to reveal a widespread feeding mechanism (capillary action and liquid bridge formation) that is potentially shared among Lepidoptera and Diptera when feeding from porous surfaces. In addition, this method can be used for studies of feeding mechanisms among a variety of fluid-feeding insects, including those important in disease transmission and biomimetics, and potentially other studies that involve nano- or micro-sized conduits where liquid transport requires verification.

Fluid-feeding insects have the ability to acquire minute quantities of liquids from porous surfaces. This protocol describes a method to directly determine the ability for insects to ingest liquids from porous surfaces using feeding solutions with fluorescent, magnetic nanoparticles.

L’Ingestion de Fluorescent, nanoparticules magnétiques permettant de déterminer les capacités d’absorption de liquide chez les insectes

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence in real time has been established without the need to count cells in single cell suspension to avoid any growth perturbation. A high-content image analysis system was used to assess iPCS confluence on 4 different ECMs over time in an automated manner. Different analysis settings were used to assess cell confluence of adherent iPSCs and only a slight difference (at 24 and 48 hours with laminin) has been observed whether a 60, 80 or 100% mask was applied. We also show that laminin lead to the best confluence compared to Matrigel, vitronectin and fibronectin.

The goal of the protocol is to compare different extracellular matrix (ECM) coating conditions to assess how differential coating affects the growth rate of induced pluripotent stem cells (iPSCs). In particular, we aim to set up conditions to obtain optimal growth of iPSC cultures.

Mesure de la confluence des CSPi à l’aide d’un système d’imagerie automatisé.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.