תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

Summary

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע אימונוהיסטוכימיה על הזחל תסיסנית גזור.

Abstract

Protocol

לפני שתתחיל

1. הכן את הפתרונות הבאים: PBT (0.1% טריטון X100 ב 1X PBS), PBTB (0.2% BSA ב PBT), ו PBTN (NGS 2% PBTB).
2. לנתח הזחלים תסיסנית. נא עיין תסיסנית Dissection הזחל NMJ.

אימונוהיסטוכימיה

1. הזז את הזחלים כדי צינור 1.5 מ"ל המכיל PBT. שטפו את הזחלים פעמיים במשך 15 דקות ב PBT. הערה: לשטוף, במקום צינור 1.5 מ"ל על מערבל nutator. הסר את הנוזל עם pippetor ולהחליף אותו נוזל טרי.
2. הסר את PBT. שטפי ב PBTB פעמיים במשך 30 דקות.
3. הסר את PBTB. שטפי ב PBTN פעמיים במשך 15 דקות.
4. מדגירים את הנוגדן העיקרי מדולל PBTN ב temp מקום 1 שעה או ב-C º 4 לילה.
5. שטפו פעמיים עם PBTB. הערה: לשטוף פתרון להוסיף ולהסיר במהירות.
6. לשטוף פעמיים במשך 15 דקות ב PBTB.
7. שטפי ב PBTN במשך 30 דקות.
8. דגירה של נוגדנים משני (ו נוגדן ראשוני מצומדות אם אתה משתמש אחד) מדולל PBTN.
9. מכסים בנייר אלומיניום דגירה עבור 1.5 שעות בטמפרטורת החדר.
10. שטפו פעמיים עם PBTB.
11. לשטוף פעמיים במשך 15 דקות עם PBTB.
12. המשך גובר.

הרכבה

הערה: הר של גליצרול אם דגימות יהיה צילמו מיד. הר זהב ב להאריך אם דגימות יאוחסן לפני הדמיה (עבור יותר משבוע) או אם דגימות חייב להיות צילמו מספר פעמים. כדי להשתמש, במקום בקבוק להאריך באמבט 65 מעלות צלזיוס מים למשך 2-3 דקות. קח aliquot של זהב להאריך ולשמור על הבלוק החום בבית 45-50 º C.

1. יוצקים preps מוכתם ב PBT כדי זכוכית שעון.
2. שים קצת גליצרול בשקופית זכוכית נקייה לעיבוד.
3. העברת בעלי חיים להחליק עיבוד באמצעות בחירת אותם זכוכית השעון על ידי בפינה באמצעות מלקחיים. ודא שהם צד לציפורן למטה.
4. הסר את הראש ואת הזנב בסכין גילוח טרי בשקופית עיבוד זכוכית. Exacto סכין עם להב # 16 עובד היטב עבור זה.
5. בשקופית נוספת (הרכבה שקופיות), לשים טיפה קטנה של גליצרול / להאריך ולהפיץ אותה עם מלקחיים נקיות.
6. העברת בעלי חיים גזור כדי להחליק את הרכבה של קצה שלהם, נזהרת שלא להפוך אותם. נסה לעלות אותם בשורות בכיוון זהה. הר 6-8 חיות לכל שקופית.
7. טיפה להחליק לכסות על ידי הצבת יתרון לתוך גליצרול / להאריך ולאט לאט משחררים אותו.
8. חותם את השקופית עם מסמר לכה. [הערה אל התמונה עד לכה הוא יבש. זה בדרך כלל לוקח עשר דקות. לקבלת דוגמיות רכוב בזהב להאריך, לתת השקופיות יבש במשך לפחות שלוש שעות לפני איטום או הדמיה.]

Discussion

אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא חיונית לחקר הביולוגיה NMJ משום שהוא מאפשר הדמיה של NMJ. מטרה זו מושגת על ידי שימוש בנוגדנים המזהים את הממברנה העצבית (למשל, HRP), את presynapse (למשל, CSP, SYT), ו / או postsynapse (למשל, DLG). מולקולות איתות, חלבונים מבניים, או חלבונים רומן עניין גם יכול להיות מוכתם. וא...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope “Stemi” 2000	Carl Zeiss, Inc.	495101-9804-000
Light Source KL 1500 LCD	Carl Zeiss, Inc.	000000-1063-181
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools	11200-33
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Adams™ Nutator Mixer	BD Biosciences	421105
No.1 Precision knife	X-Acto	3201
No. 16 Blades	X-Acto	216
ProLong Gold Antifade reagent	Invitrogen	36930