Drosophila 애벌레 NMJ Immunohistochemistry

요약

이 프로토콜은 해부 Drosophila의 유충에 immunohistochemistry을 수행하는 방법을 보여줍니다.

초록

프로토콜

당신이 시작하기 전에

1. 다음과 같은 솔루션을 준비 : PBT (1X PBS에 0.​​1 %의 트리톤의 X100), PBTB (0.2 % PBT에서 BSA) 및 PBTN (PBTB에서 2 % NGS)을.
2. Drosophila의 유충을 해부하다. Drosophila 애벌레 NMJ의 절개를 참조하십시오.

Immunohistochemistry

1. PBT를 포함하는 1.5 ML 튜브에 애벌레로 이동합니다. PBT에서 15 분 동안 두 번 애벌레를 씻으십시오. 참고 : 세척하는 nutator 믹서에 1.5 ML 튜브를 놓습니다. pippetor와 액체를 제거하고 신선한 액체로 대체합니다.
2. PBT를 제거합니다. 30 분 두 번 PBTB로 씻으십시오.
3. PBTB를 제거합니다. 15 분 동안 두 번 PBTN로 씻으십시오.
4. 1 시간 또는 밤새 4 º C에서 온도는 실온에서 PBTN에 희석 일차 항체에 품어.
5. PBTB로 두 번 씻어. 참고 : 추가적인 솔루션을 씻어 신속하게 제거하실 수 있습니다.
6. PBTB에서 1​​5 분 동안 두 번 씻으십시오.
7. 30 분 PBTN로 씻으십시오.
8. PBTN에 희석 보조 항체 (그리고 하나를 사용하는 경우에는 복합 기본 항체)에 품어.
9. 상온에서 1.5 시간 동안 석박과 부화에 커버.
10. PBTB로 두 번 씻어.
11. PBTB와 함께 15 분 동안 두 번 씻으십시오.
12. 설치를 진행합니다.

설치

참고 : 샘플은 즉시 몇 군데가 될 수 글리세롤에 마운트합니다. 샘플 이미징 전에 저장됩니다 경우 (일주일 이상) 또는 시료가 여러 번 몇 군데해야하는 경우 골드 연장에 탑재합니다. 사용하려면, 2-3 분 동안 65 º C의 물을 욕조에 연장의 병을 넣으십시오. 골드 연장의 나누어지는를 타고 45-50 º C.에 열을 블록에 유의

1. 시계 유리에 PBT의 스테인드 preps 하거라.
2. 처리를위한 깨끗한 유리 슬라이드에 일부 글리세롤 놔.
3. 포셉을 사용하여 모서리로 시계 유리의 그들을 채취하여 처리 슬라이드로 동물을 이동합니다. 그들은 아래 표피 사이드 있도록.
4. 가공 유리 슬라이드에 신선한 면도날로 머리와 꼬리를 제거합니다. 블레이드 # 16과 함께 exacto - 칼로이 일을 잘 작동합니다.
5. 다른 슬라이드에 (슬라이드를 장착), 글리세롤의 작은 방울을 넣어 / 청소 집게로 연장하고 확산.
6. 그들을 반대로하지 돌보는 그들의 가장자리에 의해 장착 슬라이드를 해부 동물을 이동합니다. 같은 방향으로 행에서 그들을 탑재하려고. 슬라이드마다 6-8 동물을 탑재합니다.
7. 연장 / 글리세롤에 우위를 넣어 천천히 그것을 출시하여 표지 용지를 놓습니다.
8. 손톱 광택과 슬라이드를 밀봉합니다. 참고 [니스가 마른 때까지 이미지를하지 마십시오. 이것은 일반적으로 10 분 걸립니다. 연장 황금 장착 샘플, 밀폐 또는 영상 이전에 최소한 세 시간은 슬라이드를 건조하게.]

토론

그것은 NMJ의 시각화를 가능하게하기 때문에 Immunohistochemistry (IHC)는 NMJ 생물학 연구를위한 중요합니다. 이것은의 연결 멤브레인 (예 : HRP), presynapse (예 : CSP, SYT), 및 / 또는 postsynapse (예 : DLG)를 인식 항체를 사용하여 수행됩니다. 신호 분자, 구조 단백질, 또는 관심있는 소설 단백질도 얼룩 수 있습니다. 그렇다면 유전자가 변이된 또는 missexpressed하고, IHC는 시냅스 구조 및 / 또는의 연결 신호의 섭동?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope “Stemi” 2000	Carl Zeiss, Inc.	495101-9804-000
Light Source KL 1500 LCD	Carl Zeiss, Inc.	000000-1063-181
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools	11200-33
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Adams™ Nutator Mixer	BD Biosciences	421105
No.1 Precision knife	X-Acto	3201
No. 16 Blades	X-Acto	216
ProLong Gold Antifade reagent	Invitrogen	36930