果蝇幼虫NMJ免疫

摘要

此协议表明如何执行解剖果蝇幼虫的免疫组织化学。

摘要

“

研究方案

在您开始之前

1. 准备了以下解决方案：PBT（0.1％海卫X100在1X PBS），PBTB（0.2％BSA在PBT），和PBTN（在PBTB 2％的农工商超市）。
2. 解剖果蝇幼虫。请参阅果蝇幼虫NMJ夹层。

免疫组织化学

1. 移动到1.5 ml管中含有PBT的幼虫。幼虫洗净两次15分钟的PBT。注意：洗净，放在一个nutator混频器1.5 ml管。与pippetor取出的液体，并用新鲜的液体取代它。
2. 卸下的PBT。 30分钟，在PBTB两次清洗。
3. 取出的PBTB。在PBTN清洗两次15分钟。
4. 孵育在稀释后在室温中PBTN 1小时或4 ° C过夜的主要抗体。
5. 冲洗两次PBTB。注：冲洗添加解决方案，并迅速删除。
6. PBTB 15分钟两次清洗。
7. 在PBTN洗为30分钟。
8. 孵育在二次抗体稀释在PBTN（和标记的抗体，如果你正在使用的一个）。
9. 在锡纸孵育盖在室温下为1.5小时。
10. 冲洗两次PBTB。
11. PBTB 15分钟两次清洗。
12. 继续安装。

安装

注：如果样本将被立即成像甘油山。如果样品将被保存一个多星期前成像，或者如果样品必须成像多次延长黄金山。若要使用，延长2-3分钟，在65℃水浴中放置一个瓶子。延长黄金等份，并保持在45-50 º C的热块

1. 在PBT倒在一块手表玻璃染色PREPS。
2. 一些甘油放在一个洁净的载玻片进行处理。
3. 手表玻璃挑选出来一个角落使用镊子，将动物处理幻灯片。确保他们是角质层的一面朝下。
4. 删除处理载玻片上的新鲜刀片的头部和尾部。这exacto刀与刀片＃16。
5. 在另一张幻灯片（幻灯片安装），把一个小滴甘油/延长和蔓延，用干净的镊子。
6. 将解剖的动物，其边缘安装的幻灯片，照顾，而不是反转。尝试安装在相同的方向行。山6-8动物每张幻灯片。
7. 下降上盖玻片放入甘油EDGE /延长，慢慢地释放它。
8. 指甲油密封的幻灯片。注[不要形象，直到清漆干燥。这通常需要10分钟。安装在延长黄金样品，让幻灯片的干燥密封或成像前至少三个小时。]

讨论

免疫组织化学（IHC）NMJ生物学研究是至关重要的，因为它使可视化的NMJ。这是通过使用的抗体，承认神经细胞膜（如辣根过氧化物酶），突触前（例如，CSP，SYT），和/或postsynapse（例如，DLG）。信号分子，结构蛋白，或利益的新的蛋白质，也可以染色。然后，基因突变或missexpressed，和IHC检测突触的结构和/或神经信号的扰动。

果蝇 NMJ年初以来，照亮它的基本结构和功?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope “Stemi” 2000	Carl Zeiss, Inc.	495101-9804-000
Light Source KL 1500 LCD	Carl Zeiss, Inc.	000000-1063-181
Dumont SS Forceps	Fine Science Tools	11200-33
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Adams™ Nutator Mixer	BD Biosciences	421105
No.1 Precision knife	X-Acto	3201
No. 16 Blades	X-Acto	216
ProLong Gold Antifade reagent	Invitrogen	36930