JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

טכניקה זו חושפת את neuromusculature עובריים תסיסנית עבור אימונוהיסטוכימיה או הקלטה אלקטרו. זה שימושי לחקר אירועי מוקדם בהתפתחות neuromuscular או ביצוע electrophysiology ב מוטנטים שאינם יכולים לבקוע.

Abstract

תסיסנית הוא מודל גנטי המוביל במחקר של פיתוח הן עובריים המוח תפקודית. באופן מסורתי, בתחומים אלה הם די מבודדים אחד מהשני, עם היסטוריה עצמאית במידה רבה קהילות מדעיות. עם זאת, הממשק בין שדות אלה נבדלים בדרך כלל התוכניות התפתחותית תפקודית הבסיסית רכישת נכסים איתות חשמלי הבחנה של סינפסות כימיות תפקודית במהלך השלבים האחרונים של הקמת מעגל עצבי. ממשק זה הוא אזור חשוב ביותר לחקירה. ב תסיסנית, אלה שלבים של התפתחות תפקודי להתרחש בתקופה של <8 שעות (במהירות של 25 ° C) במהלך השליש האחרון של העובר. תקופה זו התפתחותי מאוחר נחשב ארוך סורר אל בשל חקירה בתצהיר של הציפורן, קשה אפידרמיס חדיר. מראש היה פריצת דרך ביישום של דבק מים polymerizing כירורגית כי ניתן להחיל באופן מקומי כדי לאפשר לציפורן לנתיחה מבוקר של עוברים בשלב מאוחר. עם חתך אורכי הגבי, העובר יכול להיות מונח שטוח, חשיפת עצבים בחוט הגחון ועל קיר שרירי הגוף חקירה ניסויית. מערכת זו הייתה בשימוש רב לבודד ולאפיין מוטציות גנטיות הפוגעות במבנה סינפסה העוברית, וכך לגלות את המנגנונים המולקולריים השולטים מפרט והבחנה של קשרים סינפסה ופונקציונלי תכונות האיתות הסינפטי.

Protocol

חלק 1: ציוד ואספקה

  1. מיקרוסקופ לנתיחה טוב נדרש והניתוחים העובר; הגדלה 40X הוא הציע, עם עיניים חתיכות 25X כדי להגדיל הגדלה מקסימלית.
  2. מלקחיים פיין (מספר 5) נדרשים עבור בחירה ידנית של עוברים devitellinization של עוברים.
  3. ציוד ליצור ולשנות מחטים זכוכית עדין נדרשת. משך זכוכית מחטים נדרשים עבור הניתוח. אנחנו מעדיפים זכוכית מוצקה לנתיחה (האחרון יותר), אבל צינורות תקן קירות זכוכית עבה (קוטר חיצוני 1-1.5 מ"מ) עובד גם כן. כמה אנשים משתמשים במחטים טונגסטן בסדר, electrolyzed כדי החדות הרצוי באמבט של 1M NaOH באמצעות סוללה 10 + Amp autotransformer. חידד לנתיחה מחטים טונגסטן נהנים כי הם עמידים יחסית לטווח ארוך. מחטים זכוכית חלולים (בדומה נוצר כתם אלקטרודות מהדק) מחוברים צינורות פלסטיק המשמשים במהלך לנתיחה עבור יניקה גירוש מלוחים, כמו גם במסירה מבוקרת של דבק. מגוון מושכי זכוכית זמינים עבור ייצור זכוכית מחטים. המחשב מתוכנתים מראש מושכי ניתן למשוך מגוון רחב של צורות וגדלים. בראון-Flaming מודלים (סאטר Instrument ושות) הם העדיפו נרחב. מיקרוסקופ המתחם (20-40X המטרה) צריכים להיות זמינים כדי לבדוק ולשנות אלקטרודות לפני השימוש.
  4. שני סוגים של פתרונות נפוצים אמבטיה הרקמות עובריים במהלך דיסקציה: 1) "רגילה" (יאן יאן, 1976a) או "תקן שונה" (Broadie, 2000) salines, המבוססת על פתרונות נפוץ במערכות הקלטה חוליות אחרים , ו 2) "haemolymph דמוי" (HL) salines (סטיוארט et al 1994), פשרה בין מלח רגיל הריכוזים יוניים נמדד haemolymph תסיסנית. יצוין, כי אף אחד salines אלה לחקות במדויק את ההרכב הכימי של haemolymph in vivo (Broadie, 2000). התקן מכיל מלח (מ"מ): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 1.8 CaCl 2, 72 סוכרוז, 5 TES, pH 7.2. הניסויים מומלץ גם לשקול מלוחים חרקים מוכן מסחרית (Media חרקים למשל של שניידר), אשר אינו מתאים הקלטה אלקטרו אבל הסיכוי הטוב ביותר להגן על בריאות רקמות חשוף.

חלק 2: קביעת העובר Dissection

  1. עבור אוסף ביצה אופטימלי, לשמור על הצעירים (<7 ימים), זכר בריא זבובים הנקבה (20-40) על סירים הנחת טרי במשך 2-3 ימים. סירים הנחת כלל מורכב 100 מ"ל כוסות פלסטיק (Tri-יוצקים) מחורר כדי לספק זרימת אוויר נאותה, המשתרעים על צלחת אגר 60 מ"מ. צלחות אגר להכיל תפוחים או מיץ ענבים מוקשה עם אגר. קיימים מספר מתכונים, אך דוגמה אחת היא כדלקמן: 700 מ"ל מים, 25-30 גרם אגר, 300 מ"ל של מיץ להתרכז (ענבים או תפוח), 0.5g מתיל paraben (p-hydroxymethylbenzoate), סוכר 30G. החיטוי המים אגר, ובנפרד לרתיחה p-hydroxymethylbenzoate עם הסוכר ומיץ. מערבבים את אגר פתרונות מיץ במהירות לשפוך לתוך צלחות 60 מ"מ, הסרת בועות.
  2. לפני איסוף ביצים, זבובים ניזונים עם הדבק שמרים (7 גרם שמרים האופה ב 9 מ"ל מים המאוחסן ב 4 ° C) על צלחות טריים, השתנה לפחות פעמיים ביום במשך לפחות יומיים. ביום 3, סיר טוב צריך לייצר 100-200 ביצים לשעה. הנחת ביצה טובה יותר היא נצפתה על סיר שמרו על צידו עם אגר בצלחת שרוט. עוברים רבים יהיה מונח בתוך או ליד שריטות.
  3. כדי לאסוף מספר גדול של עוברים, בעדינות העברת עוברים מצלחת אגר לתוך סל באמצעות מכחול. סל יכול להתבצע עם צינור 15 מ"ל או 50 צנטריפוגות. חותכים את תחתית עוזב פני השטח מספיק כדי ללכוד מסך (70 מיקרומטר רשת) בין המכסה העליון של הצינור. שוטפים את העוברים עם DH 2 0 והכניסו בצלחת פטרי של אקונומיקה 50% עד 100% טרי להסיר את סיסית החיצונית. לחלופין, ניתן לאסוף ביצים בנפרד באמצעות מלקחיים בסדר, dechorionated ידי הצבת אותם באופן ידני לתוך ירידה של אקונומיקה. De-chorionation יכול לקחת בין 30 שניות עד 2 דקות (אקונומיקה טרי הוא הרבה יותר מהר), ואת צריכה להיות במעקב תחת מיקרוסקופ לנתיחה. הסרת סיסית חושף את מבריק, שקוף קרום vitelline. ביצים Dechorionated יש לשטוף קצר, או להציב מלוחים, כמו אקונומיקה במהירות הורס רקמות devitellinized.
  4. זה קריטי כדי בזהירות בשלב עוברי לגיל ההתפתחותי הרצוי. הגדיר תסיסנית בשלבים עובריים (1-17; קמפוס, אורטגה Hartenstein, 1985) אינם מועילים, כמו כל פיתוח neuromuscular תפקודית מתרחשת בשלב מאוחר או 16 שלב 17. כך, עוברים הם מבוימים על ידי שעות התפתחותי של 25 מעלות צלזיוס חממה humidified, שעות לאחר ההפריה או, בדרך כלל, לאחר הנחת ביצה (AEL). בתנאים אלה, embryogenesis נמשך 21 + / - 1 שעה בשעה 25 ° C.
  5. ביצים מתוזמן הביצה שכבה (1-2 שעותים) כי הם בני כראוי נתפסים הבא קריטריונים מורפולוגיים. אחרי כביסה נרחב DH 2 O, הביצים dechorionated ממוקמות בצלחת תרבות פלסטיק (תחת DH 2 O) לצורך צפייה. בימוי נכון ניתן לאשר קריטריונים מורפולוגיים באמצעות האור המוחזר עם מיקרוסקופ דיסקציה (קמפוס, אורטגה Hartenstein, 1985). בוגר בשלב מאוחר עוברי (22-24h AEL) על סף הבקיעה מוכרים בדרך כלל על ידי פילוח לציפורן, קנה הנשימה מנופח. עוברים יכול להיות גם genotyped באמצעות GFP balancers ו מיקרוסקופ פלואורסצנטי דיסקציה עם מסננים מתאימים.
  6. עבור לנתיחה, עוברים dechorionated ו התפתחותית מבוים מחוברים (צד הגב למעלה) על coverslip תחת טיפת מלח (ראה שלב 1.5). עוברים יוסרו מן הקרום vitelline על ידי ניקוב הממברנה סמוך לקצה הקדמי או האחורי עם micropipette כוס או מחט טונגסטן, ולאחר מכן לשחרר בעדינות את העובר מן הממברנה. לקראת לנתיחה, העובר צריך להיות ממוקם על coverslip עם את פני השטח הגבי (צד הגב עד לנתיחה יחשוף את מערכת העצבים ואת הגחון neuromusculature לניסויים. עם זאת, ברור העובר יכול להיות ממוקם בדרכים אחרות כדי להקל את הגישה אחרים רקמות).
  7. עוברים בשלב מוקדם (<16 שעות AEL) לצרף ישירות לנקות זכוכית או זכוכית מצופה polylysine (poly-L-ליזין hydrobromide; Broadie ו בייט, 1993a, b). עוברים מבוגרים יותר (> 16 שעות AEL), לאחר היווצרות לציפורן, חייב להיות דבוק, באופן אידיאלי Sylgard מצופה (Dow Corning) coverslips. דבק מים polymerizing כירורגי או וטרינרי cyanoacrylate משמש (Broadie ו בייט, 1993c, ד). דבק מועברת באמצעות פיפטה אלקטרודה זכוכית קטנה (10-20 קצה הפנימי מיקרומטר קוטר) מחוברת צינורית גומי עם הזרם דבק בשליטת לחץ פה. יש להקפיד במהלך הלידה דבק, כמו דבק polymerizes במהירות על קשר עם מי מלח. שים לב גם כי הדבקה לא יכול להתבצע ללא מלח או נמוך ריכוזי יון divalent, כמו דבק דורש יונים divalent כדי לפלמר. כמויות קטנות של דבק משמשים הראשון בתוקף לצרף את הראש והזנב.
  8. לאחר סיום של העובר מודבקות coverslip, מבצעים חתך לאורך קו האמצע הגב עם אלקטרודות זכוכית או מחט טונגסטן חידד. זה נעשה קל יותר בעדינות על ידי ניקוב את קו החתך לפני ביצוע החתך הסופי. הצדדים של החתך מחוברים אז coverslip עם דבק יותר, בעדינות כדי להפיץ את שטוח העובר. איברים פנימיים, כולל המעי, גופים שומן, אופציונלי, קנה הנשימה יוסרו מכן על ידי יניקה בעזרת פיפטה זכוכית המחובר בצינור גומי (Broadie בייט ו 1993a-c). העובר כעת אמור להיות מצורף שטוח coverslip, האפידרמיס למטה עם הגחון מערכת העצבים המרכזית, העצבים ההיקפיים, השרירים ואת סומטיים חשוף לניסויים.

Discussion

בימוי מדויק של עוברים הוא קריטי עקב ההבשלה המהירה של מאפיינים פונקציונליים במשך תקופה של רק כמה שעות. מספר נושאים לסבך זה הזמני. ראשית, רוב החוקרים להשתמש ביצה מתוזמן מטילה על עוברי הבמה, אבל הפעם ההטלה יכול להשתנות מאוד מן החי חיים בתנאים שונים (Broadie et al. 1992). בפרט, נשים...

Acknowledgements

KB הוא נתמך על ידי NIH מענק GM54544.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Embryo Collection CagesGenesee Scientific59-100 (for 60 mm dish; other sizes available)Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video
Sylgard 184Dow CorningAvailable from various companiesSurgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips
Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mmVariousFor pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery
Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue applicationTygonTubing inner diameter needs to match glass outer diameter.

References

  1. Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
  2. Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmembrane protein on peripheral glia, is required to form the blood-nerve barrier in Drosophila. Cell. 81, 757-767 (1995).
  3. Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
  4. Baines, R. A., Robinson, S. G., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Postsynaptic expression of tetanus toxin light chain blocks synaptogenesis in Drosophila. Curr. Biol. 9, 1267-1270 (1999).
  5. Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
  6. Bate, M. The embryonic development of the larval muscles in Drosophila. Development. 110, 791-804 (1990).
  7. Bate, M., Martinez Arias, A., Bate, M., Martinez Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).
  8. Baumgartner, S., JT, L. i. t. t. l. e. t. o. n., Broadie, K., MA, B. h. a. t., Harbecke, R., JA, L. e. n. g. y. e. l., Chiquet-Ehrismann, R., Prokop, A., Bellen, H. J. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87, 1059-1068 (1996).
  9. AH, B. r. a. n. d. Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  10. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  11. Broadie, K., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Electrophysiological Approaches to the Neuromusculature. Drosophila Protocols. , 273-296 (2000).
  12. Broadie, K., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 144-166 (1993a).
  13. Broadie, K., Bate, M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 167-180 (1993b).
  14. Broadie, K., Bate, M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis. Neuron. 11, 607-619 (1993c).
  15. Broadie, K., Bate, M. Synaptogenesis in the Drosophila embryo: innervation directs receptor synthesis and localization. Nature. 361, 350-353 (1993d).
  16. Broadie, K., Bellen, H. J., DiAntonio, A., Littleton, J. T., Schwarz, T. L. The absence of Synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10727-10731 (1994).
  17. Broadie, K., Prokop, A., Bellen, H. J., O'Kane, C. J., Schulze, K. L., Sweeney, S. T. Syntaxin and Synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila. Neuron. 15, 663-673 (1995).
  18. Broadie, K., Rushton, E., Skoulakis, E. C. M., Davis, R. L. e. o. n. a. r. d. o. a 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19, 391-402 (1997).
  19. Broadie, K., Skaer, H., Bate, M. Whole-embryo culture of Drosophila: development of embryonic tissues in vitro. Roux's Arch. Develop. Biol. 201, 364-375 (1992).
  20. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
  21. Deitcher, D. L., Ueda, A., Stewart, B. A., Burgess, R. W., Kidokoro, Y., Schwartz, T. L. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J. Neurosci. 18, 2028-2039 (1998).
  22. Featherstone, D. E., Broadie, K. Surprises from Drosophila: genetic mechanisms of synaptic development and plasticity. Brain Res. Bull. 53, 501-511 (2000).
  23. Featherstone, D. E., Rushton, E. M., Hilderbrand-Chae, M., Phillips, A. M., Jackson, F. R., Broadie, K. Presynaptic glutamic acid decarboxylase is required for induction of the postsynaptic receptor field at a glutamatergic synapse. Neuron. 27, 71-84 (2000).
  24. Featherstone, D. E., Davis, W. S., Dubreuil, R. R., Broadie, K. Drosophila alpha- and beta-spectrin mutations disrupt presynaptic neurotransmitter release. J Neurosci. 21, 4215-4224 (2001).
  25. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nat Neurosci. 5, 141-146 (2002).
  26. Featherstone, D. E., Rushton, E., Rohrbough, J., Liebl, F., Karr, J., Sheng, Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. An essential Drosophila glutamate receptor subunit that functions in both central neuropil and neuromuscular junction. J. Neurosci. 25, 3199-3208 (2005).
  27. Fergestad, T., Davis, W. S., Broadie, K. The stoned proteins regulate synaptic vesicle recycling in the presynaptic terminal. J Neurosci. 19, 5847-5860 (1999).
  28. Fergestad, T., Wu, M. N., Schulze, K. L., Lloyd, T. E., Bellen, H. J., Broadie, K. Targeted mutations in the syntaxin H3 domain specifically disrupt SNARE complex function in synaptic transmission. J Neurosci. 21, 9142-9150 (2001).
  29. Fergestad, T., Broadie, K. Interaction of stoned and synaptotagmin in synaptic vesicle endocytosis. J Neurosci. 21, 1218-1227 (2001).
  30. Goodman, C. S., Doe, C. Q., Bate, M., Martinez Arias, A. Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster. , 1131-1206 (1993).
  31. Harrison, S. D., Broadie, K., Goor, J. v. a. n. d. e., Rubin, G. M. Mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission. Neuron. 13, 555-566 (1994).
  32. Huang, F. D., Woodruff, E., Mohrmann, R., Broadie, K. Rolling blackout is required for synaptic vesicle exocytosis. J. Neurosci. 26, 2369-2379 (2006).
  33. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  34. Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. J. Physiol. 262, 215-236 (1976b).
  35. Kidokoro, Y., Nishikawa, K. I. Miniature endplate currents at the newly formed neuromuscular junction in Drosophila embryos and larvae. Neuroscience Research. 19, 143-154 (1994).
  36. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. J. Neurosci. 17, 9642-9655 (1997).
  37. Mohrmann, R., Matthies, H. J., Woodruff III, E., Broadie, K. Stoned B mediates sorting of integral synaptic vesicle proteins. Neuroscience. 153, 1048-1063 (2008).
  38. Nishikawa, K. I., Kidokoro, Y. Junctional and extrajunctional glutamate receptor channels in Drosophila embryos and larvae. J. Neurosci. 15, 7905-7915 (1995).
  39. Renden, R., Berwin, B., Davis, W., Ann, K., Chin, C. T., Kreber, R., Ganetzky, B., Martin, T. F., Broadie, K. Drosophila CAPS is an essential gene that regulates dense-core vesicle release and synaptic vesicle fusion. Neuron. 31, 421-437 (2001).
  40. Rohrbough, J., Broadie, K. Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission in Central Neurons of Drosophila Larvae. J. Neurophysiol. 88, 847-860 (2002).
  41. Rohrbough, J., Rushton, E., Palanker, L., Woodruff, E., Matthies, H. J., Acharya, U., Acharya, J. K., Broadie, K. Ceramidase regulates synaptic vesicle exocytosis and trafficking. J. Neurosci. 24, 7789-7803 (2004).
  42. Rohrbough, J., Rushton, E., Woodruff, E. 3. r. d., Fergestad, T., Vigneswaran, K., Broadie, K. Presynaptic establishment of the synaptic cleft extracellular matrix is required for postsynaptic differentiation. Genes Dev. 21, 2607-2628 (2007).
  43. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol.. A175, 179-191 (1994).
  44. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
  45. Tsunoda, S., Salkoff, L. Genetic analysis of Drosophila neurons: Shal, Shaw, and Shab encode most embryonic potassium currents. J. Neurosci. 15, 1741-1754 (1995).
  46. Ueda, A., Kidokoro, Y. Longitudinal body wall muscles are electrically coupled across the segmental boundary in the third instar larva of Drosophila melanogaster. Invertebrate Neuroscience. 1, 315-322 (1996).
  47. Wu, C. F., Haugland, F. N. Voltage clamp analysis of membrane currents in larval muscle fibers of Drosophila. J. Neurosci. 5, 2626-2640 (1985).
  48. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. J Neurosci Methods. 162, 198-205 (2007).
  49. Yoshikami, D., Okun, L. Staining of living presynaptic nerve terminals with selective fluorescent dyes. Nature. 310, 53-56 (1984).
  50. Zagotta, W. N., Brainard, M. S., Aldrich, R. W. Single-channel analysis of four distinct classes of potassium channels in Drosophila muscle. J. Neurosci. 8, 4765-4779 (1988).
  51. Zhang, Y. Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. A living synaptic vesicle marker: synaptotagmin-GFP.. Genesis. 34, 142-145 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Neuroscience27clampneuromuscular

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved