JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Protokol
  • Tartışmalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu teknik immünohistokimya veya elektrofizyolojik kayıt için Drosophila embriyonik neuromusculature ortaya çıkarır. Nöromüsküler gelişiminde erken olayları okuyan veya yumurtadan değil mutantlar elektrofizyoloji yapmak için yararlıdır.

Özet

Drosophila, embriyonik gelişim ve fonksiyonel nörobilim çalışma için önde gelen genetik bir model . Geleneksel olarak, bu alanlar, büyük ölçüde bağımsız geçmişleri ve bilimsel topluluklar ile, birbirinden tamamen izole edilir. Ancak, bunlar genellikle birbirinden farklı alanlar arasında arayüz fonksiyonel elektriksel sinyal özellikleri ve nöral devre oluşumu son aşamalarında fonksiyonel kimyasal sinaps farklılaşma edinimi temel gelişim programları. Bu arayüz, soruşturma için son derece önemli bir alandır. Drosophila, fonksiyonel gelişimi bu aşamalarda son embriyogenez üçüncü sırasında <8 saatlik bir süre (25 ° C) sırasında oluşur. Bu geç gelişim döneminde uzun, sert, geçirimsiz epidermal manikür birikimine soruşturma nedeniyle dirençli kabul edildi. Bir atılım önceden yerel kontrollü geç evre embriyo diseksiyonu etkinleştirmek için manikür uygulanabilir, su polimerize cerrahi yapıştırıcı uygulama oldu. Dorsal longitudinal insizyon ile deneysel olarak incelenmesi için embriyonun ventral sinir kablosu ve vücut duvarı kas açığa, düz belirtilen olabilir. Bu sistem, ağır embriyonik sinaps oluşumunu bozar ve dolayısıyla sinaps bağlantıları ve fonksiyonel sinaptik sinyalizasyon özellikleri şartname ve farklılaşmasını düzenleyen moleküler mekanizmaları ortaya genetik mutantları ve karakterize etmek için kullanılmaktadır.

Protokol

Bölüm 1: Ekipman ve Malzemeleri

  1. Iyi bir diseksiyon mikroskobu, embriyo diseksiyonları için gerekli olan; 40X büyütme 25X göz adet ile maksimum büyütme artırmak için önerilmektedir.
  2. Güzel forseps (sayı 5), embriyo ve embriyo devitellinization manuel seçimi için gereklidir.
  3. Ekipman ince cam iğne yapmak ve değiştirmek için gereklidir. Çekti cam iğneler diseksiyon için gereklidir. Diseksiyon (uzun ömürlü) için sağlam bir cam tercih, ama standart kalın duvarlı cam tüp (dış çapı 1-1.5 mm) olarak iyi çalışır. Bazı insanlar 10 + Amp yapıldığında pil kullanarak 1M NaOH banyo istenen netlik elektroliz ince tungsten iğneler, kullanın. Bilenmiş tungsten diseksiyon iğneleri, onlar nispeten dayanıklı ve uzun ömürlü olduğunu yarar var. Çukur cam iğneler (kelepçe elektrotlar yama benzer oluşan), plastik boru bağlı ve tuzlu su emme ve kovulma diseksiyonu, tutkal gibi kontrollü teslimat sırasında kullanılır. Cam Elcikler çeşitli cam iğneler üretimi için kullanılabilir. Bilgisayar programlanmış Elcikler şekil ve büyüklükte çeşitli çekmek için önceden ayarlanmış olabilir. Brown Flaming modelleri (Sutter Instrument Co) yaygın olarak tercih edilmektedir. (20-40X objektif) bir bileşik mikroskop kullanmadan önce kontrol edin ve elektrotlar değiştirmek için mevcut olmalıdır.
  4. İki tür çözümler banyo Diseksiyon sırasında embriyonik dokularda yaygın kullanılır: 1) "standart" (Jan Jan, 1976a) ya da değiştirilmiş standart "(Broadie 2000) Salines kayıt için diğer omurgasız sistemlerinde yaygın olarak kullanılan çözümler dayalı , ve 2) "haemolymph gibi" (HL) Salines (Stewart ve ark 1994), standart tuzlu ve Drosophila haemolymph ölçülen iyon konsantrasyonları arasında bir uzlaşmadır. Bu Salines hiçbiri doğru in vivo haemolymph kimyasal bileşimi (Broadie 2000) taklit olduğu unutulmamalıdır. Standart tuzlu su içeren (mM): 135 NaCl, KCl 5, 4 MgCl 2, 1.8 CaCl 2, 72 sakaroz, 5 TES, pH 7,2. Deneyciler de elektrofizyolojik kayıt için uygun değildir ancak maruz dokuların sağlığını korumak için büyük olasılıkla ticari olarak hazırlanan böcek tuzlu su (örneğin Schneider Böcek Medya), dikkate almak isteyebilirsiniz.

Bölüm 2: Embriyo Sahneleme ve Diseksiyon

  1. En iyi yumurta toplama, genç (<7 gün), sağlıklı erkek ve dişi sinekler (20-40) 2-3 gün taze döşeme tencere korumak. Döşeme tencere sık delikli 60 mm agar plaka kapsayan yeterli hava dolaşımı sağlamak için 100 ml plastik bardak (Tri-Pour) oluşur. Agar plakaları, elma veya agar ile sertleştirilmiş üzüm suyu içeriyor. Çeşitli tarifler vardır, ama aşağıdaki gibi bir örnek: 700 ml su, 25-30 gram agar, 300 ml meyve suyu konsantresi (üzüm veya elma), 0.5g metil paraben (p-hydroxymethylbenzoate), ve 30g şeker. Su ve agar Otoklav ve ayrı olarak, şeker ve suyu ile p-hydroxymethylbenzoate kaynatın. Agar ve meyve suyu çözümleri Mix ve hızlı kabarcıkları kaldırarak, 60 mm plakalar dökün.
  2. Yumurta toplama öncesinde, en az iki gün boyunca günde en az iki kez taze plakalar üzerinde maya yapıştırın (7 gram ekmek mayası, 4 ° C'de depolanan su 9 ml), sinekler ile beslenir. 3 gün, iyi bir pot saatte 100-200 yumurta üretmek gerekir. Daha iyi yumurtlama çizik plaka agar ile yan tutulan bir pot görülmektedir. Birçok embriyolar atılmıştır veya çizik yanında olacak.
  3. Çok sayıda embriyo toplamak için, bir fırça kullanarak bir sepet içine yavaşça agar plaka embriyolar transfer. 15 veya 50 ml santrifüj tüp ile bir sepet yapılabilir. Kapak ve tüp üst (70 mikron mesh) arasında bir ekran yakalamak için yeterli yüzey alanını terk alt kesti. DH 2 0 embriyolar durulayın ve dış koryon kaldırmak için taze% 50 -% 100 ağartıcı bir Petri kabı koymak . Alternatif olarak, yumurta ince forseps kullanarak tek tek toplanır ve bir damla çamaşır suyu içine onları el koyarak dechorionated olabilir. De-chorionation 2 dakika 30 saniye (taze çamaşır suyu çok daha hızlı) alabilir ve diseksiyon mikroskobu altında izlenmelidir. Koryon kaldırılması, parlak, şeffaf vitellin membran ortaya çıkarır. Çamaşır suyu hızla devitellinized dokuları tahrip olarak Dechorionated yumurta kısaca durulanır, ya da tuzlu su yerleştirilmiş olmalıdır.
  4. Dikkatli bir şekilde istenen gelişimsel yaş embriyo aşamasında kritik öneme sahiptir. Tanımlanan Drosophila embriyonik aşamalarında tüm fonksiyonel nöromüsküler gelişme (1-17; Campos-Ortega ve Hartenstein, 1985) geç dönem 16 veya 17 sahne oluştuğunda, yararlı değildir. Bu nedenle, embriyoların gelişim saat 25 sahnelenen ° C nemlendirilmiş bir inkübatör, gübreleme veya saat sonra, daha yaygın, yumurtlama (AEL). Bu koşullar altında, embriyogenez 21 sürer + / - 1 saat 25 ° C
  5. Zamanlanmış bir yumurta yatıyordu (Yumurta 1-2 saatler) uygun yaş sonraki morfolojik kriterlerinin de izlenebilir. DH 2 O geniş yıkadıktan sonra, dechorionated yumurta görüntülemek için plastik bir kültür çanak (dH 2 O altında) yerleştirilir. Doğru evreleme bir diseksiyon mikroskobu (Campos-Ortega ve Hartenstein, 1985) ile yansıyan ışık kullanılarak morfolojik kriterlere göre teyit edilebilir. Manikür ve şişirilmiş trakea segmentasyonu kuluçka eşiğinde Olgun geç dönem embriyoların (22-24 AEL) genellikle kabul edilmektedir. Embriyolar GFP dengeleyici ve uygun filtreler ile floresan diseksiyon mikroskobu kullanılarak genotip olabilir.
  6. Diseksiyon için dechorionated ve gelişimsel sahnelenen embriyolar serum fizyolojik damla (adım 1.5 'e bakınız) altında bir lamel (yukarı sırt tarafı) bağlı. Embriyolar bir cam mikropipet veya tungsten iğne ile ön veya arka sonuna yakın membran delinmesiyle ve yavaşça membran embriyo kurtararak vitellin zarı kaldırılır. Diseksiyon için hazırlanmasında, embriyonun dorsal yüzeyi (diseksiyon ventral sinir sistemi ve deneyler için neuromusculature gösterecektir kadar Dorsal yan lamel yerleştirilmiş olmalıdır. Ancak, embriyo tabii ki diğer erişimini kolaylaştırmak için diğer şekillerde yerleştirilmiş olabilir dokular.)
  7. Erken evre (<16 saat AEL) embriyolar polylysine (Broadie ve Bate, 1993a, b poli-L-lisin hidrobromid) ile kaplı cam veya cam temizlemek için doğrudan takın. Kütikül oluşumunu takip Yaşlı embriyolar (> 16 saat AEL), ideal Sylgard kaplı (Dow Corning) lamelleri, yapıştırılmış olmalıdır. Bir su polimerize siyanoakrilat cerrahi veya veterinerlik tutkal (Broadie ve Bate, 1993c, d) kullanılır. Yapıştırıcı, tutkal akışı ile ağız basıncı ile kontrol edilen bir lastik tüpüne bağlı küçük bir cam elektrot pipet (10-20 mikrometre iç çapı ucu) ile teslim edilir. Tutkal serum fizyolojik ile iletişime üzerine hızla polimerize olarak Bakımı, tutkal teslimat sırasında alınmalıdır. Bu yapıştırma, tutkal kalsiyum iyonları polimerize gerektirir, tuzlu su veya düşük kalsiyum iyon yoğunluğunun içinde yapılan olamaz unutmayın. Küçük miktarda tutkal ilk baş ve kuyruk sıkıca bağlamak için kullanılır.
  8. Embriyo biter lamel yapıştırılmış sonra, bilenmiş bir cam elektrot veya tungsten iğne ile dorsal orta hat boyunca bir kesi yapılır. Bu hafifçe final cut yapmadan önce kesi hattı perforan tarafından daha kolay yapılır. Daha sonra kesi kenarları hafifçe embriyo düz yaymak için, daha fazla yapıştırıcı ile lamel bağlıdırlar. Bağırsak, yağ organları ve isteğe bağlı olarak, trakea sonra lastik borular (Broadie Bate 1993a-c) bağlı bir cam pipet kullanarak emme tarafından kaldırılır de dahil olmak üzere iç organlar. Embriyo artık ventral merkezi sinir sistemi ile epidermisin aşağı, periferik sinirler, lamel için düz bağlı ve somatik kas deneyler için açık olmalıdır.

Tartışmalar

Embriyo kesin evreleme nedeniyle fonksiyonel özellikleri, sadece birkaç saat zaman boyunca hızlı bir şekilde olgunlaşması için çok önemlidir. Çeşitli konularda bu evreleme zorlaştırıyor. İlk olarak, pek çok araştırmacı dönem embriyoların zaman yumurta bırakır, ancak yumurtlama zamanı farklı koşullar (Broadie ve ark 1992), hayvandan hayvana çok değişebilir. Özellikle kısıtlı bir diyet, kadın, uzun süre önce döşeme döllenmiş yumurta korumak eğilimindedir. Bu nedenle en az 2 gün ?...

Teşekkürler

KB NIH hibe GM54544 tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Embryo Collection CagesGenesee Scientific59-100 (for 60 mm dish; other sizes available)Cages can also be home made using punctured tri-pour beakers, as shown in video
Sylgard 184Dow CorningAvailable from various companiesSurgical glue adheres better to sylgard-coated coverslips
Fine glass tubing, outer diameter 1.0-1.5 mmVariousFor pulling into fine glass needles for dissection and tubes for glue delivery
Plastic tubing, to attach to glass pipette for mouth suction and glue applicationTygonTubing inner diameter needs to match glass outer diameter.

Referanslar

  1. Aravamudan, B., Fergestad, T., Davis, W. S., Rodesch, C. K., Broadie, K. Drosophila UNC-13 is essential for synaptic transmission. Nat. Neurosci. 2, 965-971 (1999).
  2. Auld, V. J., Fetter, R. D., Broadie, K., Goodman, C. S. Gliotactin a novel transmembrane protein on peripheral glia, is required to form the blood-nerve barrier in Drosophila. Cell. 81, 757-767 (1995).
  3. Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
  4. Baines, R. A., Robinson, S. G., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Postsynaptic expression of tetanus toxin light chain blocks synaptogenesis in Drosophila. Curr. Biol. 9, 1267-1270 (1999).
  5. Baines, R. A., Uhler, J. P., Thompson, A., Sweeney, S. T., Bate, M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J. Neurosci. 21, 1523-1531 (2001).
  6. Bate, M. The embryonic development of the larval muscles in Drosophila. Development. 110, 791-804 (1990).
  7. Bate, M., Martinez Arias, A., Bate, M., Martinez Arias, A. . The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).
  8. Baumgartner, S., JT, L. i. t. t. l. e. t. o. n., Broadie, K., MA, B. h. a. t., Harbecke, R., JA, L. e. n. g. y. e. l., Chiquet-Ehrismann, R., Prokop, A., Bellen, H. J. A Drosophila neurexin is required for septate junction and blood-nerve barrier formation and function. Cell. 87, 1059-1068 (1996).
  9. AH, B. r. a. n. d. Perrimon N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  10. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  11. Broadie, K., Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Electrophysiological Approaches to the Neuromusculature. Drosophila Protocols. , 273-296 (2000).
  12. Broadie, K., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 144-166 (1993a).
  13. Broadie, K., Bate, M. Development of larval muscle properties in the embryonic myotubes of Drosophila melanogaster. J. Neurosci. 13, 167-180 (1993b).
  14. Broadie, K., Bate, M. Activity-dependent development of the neuromuscular synapse during Drosophila embryogenesis. Neuron. 11, 607-619 (1993c).
  15. Broadie, K., Bate, M. Synaptogenesis in the Drosophila embryo: innervation directs receptor synthesis and localization. Nature. 361, 350-353 (1993d).
  16. Broadie, K., Bellen, H. J., DiAntonio, A., Littleton, J. T., Schwarz, T. L. The absence of Synaptotagmin disrupts excitation-secretion coupling during synaptic transmission. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10727-10731 (1994).
  17. Broadie, K., Prokop, A., Bellen, H. J., O'Kane, C. J., Schulze, K. L., Sweeney, S. T. Syntaxin and Synaptobrevin function downstream of vesicle docking in Drosophila. Neuron. 15, 663-673 (1995).
  18. Broadie, K., Rushton, E., Skoulakis, E. C. M., Davis, R. L. e. o. n. a. r. d. o. a 14-3-3 protein involved in learning, regulates presynaptic function. Neuron. 19, 391-402 (1997).
  19. Broadie, K., Skaer, H., Bate, M. Whole-embryo culture of Drosophila: development of embryonic tissues in vitro. Roux's Arch. Develop. Biol. 201, 364-375 (1992).
  20. Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
  21. Deitcher, D. L., Ueda, A., Stewart, B. A., Burgess, R. W., Kidokoro, Y., Schwartz, T. L. Distinct requirements for evoked and spontaneous release of neurotransmitter are revealed by mutations in the Drosophila gene neuronal-synaptobrevin. J. Neurosci. 18, 2028-2039 (1998).
  22. Featherstone, D. E., Broadie, K. Surprises from Drosophila: genetic mechanisms of synaptic development and plasticity. Brain Res. Bull. 53, 501-511 (2000).
  23. Featherstone, D. E., Rushton, E. M., Hilderbrand-Chae, M., Phillips, A. M., Jackson, F. R., Broadie, K. Presynaptic glutamic acid decarboxylase is required for induction of the postsynaptic receptor field at a glutamatergic synapse. Neuron. 27, 71-84 (2000).
  24. Featherstone, D. E., Davis, W. S., Dubreuil, R. R., Broadie, K. Drosophila alpha- and beta-spectrin mutations disrupt presynaptic neurotransmitter release. J Neurosci. 21, 4215-4224 (2001).
  25. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nat Neurosci. 5, 141-146 (2002).
  26. Featherstone, D. E., Rushton, E., Rohrbough, J., Liebl, F., Karr, J., Sheng, Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. An essential Drosophila glutamate receptor subunit that functions in both central neuropil and neuromuscular junction. J. Neurosci. 25, 3199-3208 (2005).
  27. Fergestad, T., Davis, W. S., Broadie, K. The stoned proteins regulate synaptic vesicle recycling in the presynaptic terminal. J Neurosci. 19, 5847-5860 (1999).
  28. Fergestad, T., Wu, M. N., Schulze, K. L., Lloyd, T. E., Bellen, H. J., Broadie, K. Targeted mutations in the syntaxin H3 domain specifically disrupt SNARE complex function in synaptic transmission. J Neurosci. 21, 9142-9150 (2001).
  29. Fergestad, T., Broadie, K. Interaction of stoned and synaptotagmin in synaptic vesicle endocytosis. J Neurosci. 21, 1218-1227 (2001).
  30. Goodman, C. S., Doe, C. Q., Bate, M., Martinez Arias, A. Embryonic Development of the Drosophila Central Nervous System. In The Development of Drosophila melanogaster. , 1131-1206 (1993).
  31. Harrison, S. D., Broadie, K., Goor, J. v. a. n. d. e., Rubin, G. M. Mutations in the Drosophila Rop gene suggest a function in general secretion and synaptic transmission. Neuron. 13, 555-566 (1994).
  32. Huang, F. D., Woodruff, E., Mohrmann, R., Broadie, K. Rolling blackout is required for synaptic vesicle exocytosis. J. Neurosci. 26, 2369-2379 (2006).
  33. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  34. Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. J. Physiol. 262, 215-236 (1976b).
  35. Kidokoro, Y., Nishikawa, K. I. Miniature endplate currents at the newly formed neuromuscular junction in Drosophila embryos and larvae. Neuroscience Research. 19, 143-154 (1994).
  36. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. J. Neurosci. 17, 9642-9655 (1997).
  37. Mohrmann, R., Matthies, H. J., Woodruff III, E., Broadie, K. Stoned B mediates sorting of integral synaptic vesicle proteins. Neuroscience. 153, 1048-1063 (2008).
  38. Nishikawa, K. I., Kidokoro, Y. Junctional and extrajunctional glutamate receptor channels in Drosophila embryos and larvae. J. Neurosci. 15, 7905-7915 (1995).
  39. Renden, R., Berwin, B., Davis, W., Ann, K., Chin, C. T., Kreber, R., Ganetzky, B., Martin, T. F., Broadie, K. Drosophila CAPS is an essential gene that regulates dense-core vesicle release and synaptic vesicle fusion. Neuron. 31, 421-437 (2001).
  40. Rohrbough, J., Broadie, K. Electrophysiological Analysis of Synaptic Transmission in Central Neurons of Drosophila Larvae. J. Neurophysiol. 88, 847-860 (2002).
  41. Rohrbough, J., Rushton, E., Palanker, L., Woodruff, E., Matthies, H. J., Acharya, U., Acharya, J. K., Broadie, K. Ceramidase regulates synaptic vesicle exocytosis and trafficking. J. Neurosci. 24, 7789-7803 (2004).
  42. Rohrbough, J., Rushton, E., Woodruff, E. 3. r. d., Fergestad, T., Vigneswaran, K., Broadie, K. Presynaptic establishment of the synaptic cleft extracellular matrix is required for postsynaptic differentiation. Genes Dev. 21, 2607-2628 (2007).
  43. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J. Comp. Physiol.. A175, 179-191 (1994).
  44. Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14, 341-351 (1995).
  45. Tsunoda, S., Salkoff, L. Genetic analysis of Drosophila neurons: Shal, Shaw, and Shab encode most embryonic potassium currents. J. Neurosci. 15, 1741-1754 (1995).
  46. Ueda, A., Kidokoro, Y. Longitudinal body wall muscles are electrically coupled across the segmental boundary in the third instar larva of Drosophila melanogaster. Invertebrate Neuroscience. 1, 315-322 (1996).
  47. Wu, C. F., Haugland, F. N. Voltage clamp analysis of membrane currents in larval muscle fibers of Drosophila. J. Neurosci. 5, 2626-2640 (1985).
  48. Yan, Y., Broadie, K. In vivo assay of presynaptic microtubule cytoskeleton dynamics in Drosophila. J Neurosci Methods. 162, 198-205 (2007).
  49. Yoshikami, D., Okun, L. Staining of living presynaptic nerve terminals with selective fluorescent dyes. Nature. 310, 53-56 (1984).
  50. Zagotta, W. N., Brainard, M. S., Aldrich, R. W. Single-channel analysis of four distinct classes of potassium channels in Drosophila muscle. J. Neurosci. 8, 4765-4779 (1988).
  51. Zhang, Y. Q., Rodesch, C. K., Broadie, K. A living synaptic vesicle marker: synaptotagmin-GFP.. Genesis. 34, 142-145 (2002).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 27Drosophilaembriyotam h creli yama kelep ekasn ronn rom sk ler kav aksinaps

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır