מקפיא הפשרה בתאי גזע עובריים אנושיים

Summary

מאז ג'יימס תומסון ואח' פיתח טכניקה בשנת 1998 לבודד ולגדל הס בתרבות, הקפאת תאים לשימוש מאוחר יותר, מפשיר והרחבת תאים ממלאי קפוא הפכו נהלים חשוב לבצע בתרבות הס שגרה התא. מכיוון שתאי הס רגישים מאוד הלחצים של מקפיא הפשרה, טיפול מיוחד חייב לנקוט. כאן אנו וידגים עבור מפשיר במהירות תאים הס ממניות חנקן נוזלי, ציפוי אותם על תאים עובריים של עכבר מזין, ולאט לאט הקפאת אותם לצורך אחסון לטווח ארוך.

Abstract

מאז ג'יימס תומסון

Protocol

1. הפשרה הס תאים

טרום הניסוי הקמה

1. יום אחד לפני ההפשרה תאים הס, צלחת שכבה של מזין fibroblasts העכבר מוקרן עובריים (MEF), CF1 זן, על אחד טוב של צלחת מצופה ג'לטין 6-היטב רקמות תרבות במדיום תרבות MEF (D-ממ בינוני הבסיס בתוספת 10% חום מומת FBS ו -1% שאינם חיוניים חומצות אמינו). דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO _2.
2. לפני הסרת תאים הס מ חנקן נוזלי, כדי להיות בטוח יש את כל הציוד הדרוש ואת ריאגנטים במקום ומוכנים לשימוש על מנת להבטיח להפשיר יעיל ומוצלח.

הפשרה תאים הס

3. הסר בקבוקון קריוגני של תאים הס מן מיכל אחסון חנקן נוזלי באמצעות מלקחיים ממתכת.
4. מרדדים את הבקבוקון בין כפות הידיים בכפפות במשך 3-5 שניות כדי להסיר את הכפור.
5. תעדו את המידע על תווית הבקבוקון.
6. בעזרת מלקחיים ממתכת, לטבול את הבקבוקון לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. את הבקבוקון מערבולת בעדינות ולבחון את ההתקדמות של ההפשרה לעתים קרובות (אבל מהר!) על ידי החזקת בקבוקון מול האור כדי לראות את הגודל של גביש הקרח. לא להטביע את כובע של הבקבוקון באמבט מים כמו זה יכול לזהם את התאים.
7. רק כאשר גביש קרח קטן נשאר, להטביע את הבקבוקון כולו אתנול לעקר.
8. בארון בטיחות סטרילי ביולוגי, להעביר את תכולת הבקבוקון קריוגני ישירות לחלק התחתון של צינור חרוטי 15 מ"ל.
9. לאט לאט להוסיף 4 מ"ל של מדיום תרבות הס תא (D-MEM/F-12 בינוני הבסיס בתוספת החלפת נוק 20% נסיוב, 1% שאינם חיוניים חומצות אמינו, 1% L-גלוטמין, 0.2% ו - β-mercaptoethanol 4 ng / bFGF מ"ל) אל הצינור. בעדינות רוק להמשיך לערבב את התאים המדיום החדש מתווסף הצינור.
10. צנטריפוגה את התאים למשך 5 דקות בשעה 200 x ז

ציפוי תאים הס

11. בעוד תאים הס הם בצנטריפוגה, להכין את צלחת מזין MEF על ידי תיוג עם המידע המתאים הס התא: שורת תאים, מספר קטע, ותאריך להפשיר.
12. כאשר יש בערך 2 דקות לסיום הזמן ספין, לשאוב את המדיום תרבות MEF ומוסיפים 1.0 מ"ל של PBS על הבאר.
13. תביאו את התאים pelleted הס בחזרה לארון בטיחות ביולוגית, ובזהירות לשאוב supernatant. היזהרו שלא לשאוב התא גלולה, אבל כמו supernatant להסיר כמה שיותר, כמו פתרון זה מכיל DMSO ממדיום המקפיא.
14. Re-להשעות גלולה בעדינות רבה על ידי הוספת 2.5 מ"ל של מדיום תרבות הס התא באמצעות זכוכית pipet 5 מ"ל ו pipetting 3-4 פעמים.
15. לשאוב PBS ממזין MEF טוב ולאט לאט להוסיף את כל מ"ל 2.5 ההשעיה התא הס את מוכן היטב צלחת 6-הבאר.
16. מניחים את הצלחת לתוך 37 ° C חממה בזהירות את הצלחת להחליק קדימה אחורה, מצד לצד כדי לפזר באופן שווה את התאים לאורך הבאר. אל מערבולת את הצלחת בתבנית עגולה, כדי למנוע ריכוז המושבות במרכז.
17. אפשר התאים לצרף בשעה 37 ° C ו 5% CO ₂ לילה.
18. יום אחרי ההפשרה, להסיר את בינוני (עם כל התאים הצפים) ומוסיפים 2.5 מ"ל של התרבות טרי בינוני הס התא הבאר.
19. אופציונלי: בינוני להסיר תאים ניתן להעביר צלחת מזין נפרד מוכן MEF. פעולה זו יוצרת לעיתים קרובות המושבות החדשה יכול להיות מתורבת במקביל תאים הפשרה המקורי.
20. דגירה צלחות ב 37 ° C ו-CO ₂ של 5% בין לילה.

2. הקפאת תאים הס

1. בעוד תאים הס הם בצנטריפוגה, התווית צלוחיות קריוגני בתוך ארון את הבטיחות הביולוגית, כולל קו התא, מספר קטע, ותאריך ההקפאה. צפיפות אופיינית הקפאת תאים הס הוא אחד טוב של תאים (מהצלחת 6-באר) לכל בקבוקון קריוגני.
2. כאשר תאים הס שתסיים centrifuging, להביא את הצינורות בחזרה לארון בטיחות ביולוגית. לשאוב supernatant מהצינור, נזהר לא להפריע רופף וגדוש תא גלולה.
3. Resuspend התא גלולה עם כמות מתאימה של המדיום הסלולרי הס תרבות: 0.5 מ"ל הס תרבית תאים בינוניים לכל בקבוקון קריוגני. היה עדין מאוד כאשר pipetting, כמו תאים הס להתאושש טוב יותר כאשר קפוא לחתיכות מושבה גדולה יחסית.
4. לאט לאט, בעדינות תוך כדי לזעזע את הצינור, להוסיף את הסכום המתאים (0.5 מ"ל לכל cryovial) של המדיום 2X הס תא הקפאה (60% FBS מוגדר, 20% הס התרבות תאים בינוניים, ו 20% DMSO) אל התאים. לאחר הקפאת המדיום הוא הוסיף, pipet הפתרון מאוד בעדינות 1-2 פעמים כדי לערבב.
5. במהירות אך בעדינות, מוסיפים 1 מ"ל של ההשעיה התא בקבוקון כל קריוגני.
6. העבר את מבחנות לתוך מיכל הקפאה מקום isopropanol ו-80 ° C למקפיא למשך הלילה. התאים יהיה להקפיא ב 1 ° C לדקה במיכל ההקפאה isopropanol.
7. למחרת, במהירות העברת צלוחיות קפוא מיכל לאחסון חנקן נוזלי באמצעות מלקחיים ממתכת.

נציג תוצאות

היום הראשון אחרי תאים ES אדם הם מופשרים, מושבות קטנות עשויות להופיע שקוף עשוי להיות קשה לראות מתחת למיקרוסקופ. מאז תאים ES מופשר החדש נוטים להתרבות לאט, הם יכולים לקחת כמה ימים כדי להופיע הקים מושבות (איור 1).

באיור 1. התאוששות Cell וצמיחה. תאים הס מופשר מ חנקן נוזלי היו הדמיה 1, 7 ו - 11 ימים לאחר ההפשרה.

Discussion

הסרטון מלווה מדגים שיטה הפשרה והקפאה תאים הס. תאים קפואים בחנקן נוזלי צריך להיות מופשר אמבטיה מהר ככל האפשר כדי לקבל את ההתאוששות הטובה ביותר האפשרית. זכור להיות זהיר מאוד כאשר pipetting תאים מפשיר: למזער את הטיפול התאים פיפטה בעדינות. בקבוקון אחד של תאים הס יכול להיות מצופה על כל אחד מהם גם צלחת 6-טוב, או כל הבארות של צלחת 4-באר והניח מיד בחממה. מאז culturing ארבע בארות נפרד מקטין את האפשרות לאבד את תרבות שלמה לזיהום, ומקלה לאתר מושבות תאים הס על פני השטח קטן, צלחת 4-מומלץ גם כאשר הפשרה תאים הס בפעם הראשונה.

היום הראשון לאחר ההפשרה תאים הס, מושבות קטנות עשוי להיות שקוף. לחדש את מדיום תרבות הס התא כל יום, גם אם המושבות לא נראית לעין תחת מיקרוסקופ כי זה עלול לקחת כמה ימים בתרבית של תאים הס להופיע המושבות הוקמה. חשוב להשתמש מזין טרי מצופה שכבת MEF כאשר הפשרת התאים, כמו במושבות לעיתים קרובות אינן מגיעות לגודל המתאים passaging 10 עד 12 ימים לאחר ההפשרה.

כאשר מפשיר בקבוקון מעבר נמוך של תאים הס, זהו תרגול טוב להרחיב להקפיא בקבוקונים נוספים כדי לשמור על מלאי של תאים מעבר נמוך לתרבות ניסויים עתידיים. זה גם רעיון טוב שגרתי להקפיא את כל "תוספת" תאים בריאים הס לשמור מניות קפוא. מפשיר המצליחים ביותר ותרבויות הבאים היו קפואים כמו באיכות גבוהה, מובחן, מושבות פעיל הס חלוקת התא. תאים הס להתאושש להקפיא באופן יעיל יותר אם מטופל בעדינות כמו אגרגטים תא גדול. הגודל המצרפי הסופית צריכה להיות דומה (או מעט גדול יותר) בגודל של אגרגטים מצופה לאחר מעבר לשגרה.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
D-MEM		Invitrogen	11965-092	For MEF mediumjavascript:void(0);
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified		Invitrogen	16000-044	Heat-inactivated For MEF medium
D-MEM/F-12		Invitrogen	11330-057
Knockout Serum Replacement		Invitrogen	10828-028	Pre-screen to ensure support of hES cells
bFGF		Stemgent	03-0002	Use at [4 ng/mL] final
Non-essential Amino Acids		Invitrogen	11140-050
L-glutamine		Invitrogen	25030-081	200 mM (100X) Use at [1X] final
PBS		Invitrogen	14190-250	Without Ca2+ or Mg2+
Collagenase IV		Invitrogen	17104-019	Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12
Gelatin		Sigma	G1890	Type A, Porcine
DMSO		Sigma	D2560	For freezing medium
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined		HyClone	SH300.70.01	For freezing medium
6-well plates		Nunc	140675	For general culture
4-well plates		Nunc	176740	For thawing
5 mL glass pipettes		Fisher	13-678-27E	Individually wrapped
15 mL conical tubes		Corning	430052	Polypropylene
Cryogenic vials		Nunc	5000-1020	1.5 mL capacity
Freezing container		Nalgene	5100-0001	“Mr. Frosty”