Congélation et de décongélation cellules souches embryonnaires humaines

Résumé

Ce protocole démontre comment maintenir en bonne santé, indifférencié souches embryonnaires humaines (ES) cellules.

Résumé

Depuis James Thomson

Protocole

1. La décongélation des cellules hES

Pré-montage expérimental

1. Un jour avant la décongélation des cellules hES, plaque une couche nourricière de fibroblastes de souris irradiées embryonnaires (MEF), CF1 souche, sur un puits d'une gélatine à revêtement de 6 puits plaque de culture de tissus dans un milieu de culture MEF (D-MEM complété avec un milieu de base 10% de FBS inactivé à la chaleur et 1% de non-acides aminés essentiels). Incuber une nuit à 37 ° C et CO ₂ 5%.
2. Avant de retirer les cellules hES de l'azote liquide, être sûr d'avoir tout l'équipement nécessaire et les réactifs en place et prêt à utiliser pour assurer un dégel efficace et réussie.

La décongélation des cellules hES

3. Retirer un flacon cryogénique de cellules hES du réservoir de stockage d'azote liquide à l'aide des pinces de métal.
4. Faites rouler le flacon entre les mains gantées pour les 3-5 secondes pour enlever le givre.
5. Enregistrer les informations sur l'étiquette du flacon.
6. En utilisant des pinces métalliques, immerger le flacon dans un bain d'eau à 37 ° C. Agiter le flacon doucement et observer les progrès du dégel souvent (mais rapidement!) En tenant le flacon à la lumière pour voir la taille du cristal de glace. Ne pas plonger le bouchon de la fiole dans le bain d'eau car cela pourrait contaminer les cellules.
7. Lorsque seul un cristal de glace petite demeure, immerger le flacon entier dans de l'éthanol à stériliser.
8. Dans une enceinte de sécurité biologique stérile, transférer le contenu de la fiole cryogénique directement au fond d'un tube de 15 ml conique.
9. Lentement ajouter 4 ml de milieu de culture cellulaire hES (D-MEM/F-12 milieu basal complété par le remplacement Knockout 20% de sérum, 1% de non-acides aminés essentiels, soit 1% de L-glutamine, 0,2% β-mercaptoéthanol et 4 ng / ml de bFGF) au tube. Secouez délicatement au mélange en permanence les cellules comme le nouveau média est ajouté dans le tube.
10. Centrifuger les cellules pendant 5 minutes à 200 x g.

Placage des cellules hES

11. Alors que les cellules hES sont dans la centrifugeuse, préparez la plaque d'alimentation du MEF par un marquage avec les informations hES cellule appropriée: lignée cellulaire, le numéro de passage, et la date de dégel.
12. Quand il ya environ 2 minutes sur le temps de spin, aspirer le milieu de culture MEF et ajoutez 1,0 ml de PBS dans le puits.
13. Apportez les cellules hES granulés de retour à l'enceinte de sécurité biologique, et soigneusement aspirer le surnageant. Attention à ne pas aspirer le culot cellulaire, mais enlever autant que possible le surnageant, comme cette solution contient du DMSO dans le milieu de congélation.
14. Re-suspendre le culot très doucement en ajoutant 2,5 mL de milieu de culture cellulaire hES en utilisant une pipette 5 ml en verre et de pipetage 3-4 fois.
15. Aspirer le PBS à partir du chargeur MEF bien et ajouter lentement 2,5 ml toutes les de la suspension de cellules hES au bien préparée de la plaque de 6 puits.
16. Placer la plaque dans l'incubateur à 37 ° C et glissez soigneusement la plaque d'avant en arrière, et latéralement afin de répartir uniformément les cellules à travers le puits. Ne pas remuer le plateau dans un modèle circulaire pour éviter la concentration des colonies dans le centre.
17. Laisser les cellules d'attacher à 37 ° C et CO ₂ 5% durant la nuit.
18. Le jour après le dégel, retirez le support (avec toutes les cellules flottantes) et ajoutez 2,5 ml de milieu de culture frais hES cellule pour le bien.
19. En option: Le milieu retiré et les cellules peuvent être transférés à une plaque séparée MEF préparés mangeoire. Cette étape génère souvent de nouvelles colonies qui peuvent être cultivées en parallèle avec les cellules du dégel d'origine.
20. Incuber les plaques à 37 ° C et CO ₂ 5% durant la nuit.

2. Congélation des cellules hES

1. Alors que les cellules hES sont dans la centrifugeuse, l'étiquette des flacons cryogéniques à l'intérieur de l'enceinte de sécurité biologique, notamment la lignée cellulaire, le numéro de passage, et la date de congélation. La densité typique de cellules hES congélation est un puits de cellules (à partir d'une plaque à 6 puits) par flacon cryogénique.
2. Lorsque les cellules hES sont finis centrifugation, mettre les tubes de retour à l'enceinte de sécurité biologique. Aspirer le surnageant du tube, en faisant attention de ne pas perturber le lâche-emballés culot cellulaire.
3. Reprendre le culot cellulaire avec la quantité appropriée de milieu de culture cellulaire hES: 0,5 mL hES milieu de culture cellulaire par flacon cryogénique. Soyez très doux lors du pipetage, comme les cellules hES mieux récupérer quand elle est congelée en morceaux colonie relativement importante.
4. Lentement, tout en secouant doucement le tube, ajoutez la quantité appropriée (0,5 ml par cryovial) de 2X milieu de congélation de cellules hES (60% de FBS définis, 20% moyennes de culture de cellules hES, et 20% de DMSO) pour les cellules. Une fois que le milieu de congélation est ajouté, pipette la solution extrême douceur une à deux fois pour mélanger.
5. Rapidement mais doucement, ajouter 1 mL de la suspension cellulaire dans chaque flacon cryogénique.
6. Transfert des flacons dans un contenant de congélation et les placer dans l'isopropanolune congélateur à -80 ° C la nuit. Les cellules gèle à 1 ° C par minute dans le récipient de congélation isopropanol.
7. Le lendemain, transférer rapidement les flacons congelés dans un réservoir de stockage d'azote liquide à l'aide des pinces de métal.

Les résultats représentatifs

Le premier jour après que les cellules ES humaines sont décongelés, de petites colonies peuvent apparaître transparentes et peuvent être difficiles à voir sous le microscope. Comme les cellules ES nouvellement décongelés ont tendance à proliférer lentement, ils peuvent prendre quelques jours à apparaître comme des colonies établies (figure 1).

Figure 1. La récupération et la croissance cellulaire. Cellules hES dégelée de l'azote liquide ont été imagées Jours 1, 7 et 11 après la décongélation.

Discussion

La vidéo qui l'accompagne montre une méthode pour la décongélation et la congélation des cellules hES. Cellules congelées dans l'azote liquide doivent être décongelés de bain aussi rapidement que possible afin d'obtenir la meilleure récupération possible. N'oubliez pas d'être extrêmement prudent lors du pipetage cellules dégel: minimiser la manipulation des cellules et la pipette doucement. Un flacon de cellules hES peuvent être étalés sur une ou l'autre puits d'une plaque de 6 puits, ou tous les puits d'une plaque 4-même et immédiatement placés dans l'incubateur. Depuis la culture dans quatre puits séparé réduit la possibilité de perdre toute la culture de la contamination, et il est plus facile de localiser les colonies de cellules hES sur la plus petite surface, la plaque 4-même est recommandé lors de la décongélation des cellules hES pour la première fois.

Le premier jour après la décongélation des cellules hES, les colonies sont petites et peuvent être transparents. Reconstituer le support de culture de cellules hES chaque jour, même si les colonies ne sont pas apparents sous le microscope, car il peut prendre quelques jours de culture de cellules hES d'apparaître comme des colonies établies. Il est important d'utiliser une couche fraîchement plaquée MEF alimentation lors de la décongélation des cellules, comme les colonies ne sont souvent pas atteindre une taille appropriée pour repiquage jusqu'au 10 12 jours après le dégel.

Lorsque la décongélation d'un flacon passage bas de cellules hES, il est bon d'élargir et de gel des flacons supplémentaires pour maintenir un stock de cellules passage bas pour la culture à venir et des expériences. C'est aussi une bonne idée de geler toute routine "extra" saine cellules hES de maintenir des stocks congelés. Le dégèle plus réussies et les cultures subséquentes ont été gelés en haute qualité, indifférenciée, se divisant activement les colonies de cellules hES. cellules hES récupérer un gel plus efficace s'il est manipulé doucement comme des agrégats de cellules plus grandes. La taille globale finale devrait être similaire à (ou légèrement plus grand que) la taille des agrégats plaqués après un passage de routine.

matériels

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
D-MEM		Invitrogen	11965-092	For MEF mediumjavascript:void(0);
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified		Invitrogen	16000-044	Heat-inactivated For MEF medium
D-MEM/F-12		Invitrogen	11330-057
Knockout Serum Replacement		Invitrogen	10828-028	Pre-screen to ensure support of hES cells
bFGF		Stemgent	03-0002	Use at [4 ng/mL] final
Non-essential Amino Acids		Invitrogen	11140-050
L-glutamine		Invitrogen	25030-081	200 mM (100X) Use at [1X] final
PBS		Invitrogen	14190-250	Without Ca2+ or Mg2+
Collagenase IV		Invitrogen	17104-019	Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12
Gelatin		Sigma	G1890	Type A, Porcine
DMSO		Sigma	D2560	For freezing medium
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined		HyClone	SH300.70.01	For freezing medium
6-well plates		Nunc	140675	For general culture
4-well plates		Nunc	176740	For thawing
5 mL glass pipettes		Fisher	13-678-27E	Individually wrapped
15 mL conical tubes		Corning	430052	Polypropylene
Cryogenic vials		Nunc	5000-1020	1.5 mL capacity
Freezing container		Nalgene	5100-0001	“Mr. Frosty”