Congelamento e descongelamento, células estaminais embrionárias humanas

Resumo

Desde que James Thomson et al desenvolveram uma técnica em 1998 para isolar e cultivar-tronco embrionárias humanas em cultura, as células de congelamento para uso posterior e descongelamento e expandir as células de um estoque de congelados tornaram-se procedimentos importantes realizados em cultura de rotina CTeh. Como as células-tronco embrionárias humanas são muito sensíveis ao estresse de congelamento e descongelamento, cuidados especiais devem tomadas. Aqui nós demonstrar a técnica adequada para rapidamente descongelamento CTeh de stocks nitrogênio líquido, plaqueamento em células embrionárias de rato de alimentação, e, lentamente, congelá-los para o armazenamento de longo prazo.

Resumo

Desde que James Thomson

Protocolo

1. Descongelamento células-tronco embrionárias humanas

Pré-experimental Set-up

1. Um dia antes de as células-tronco embrionárias humanas descongelamento, prato uma camada nutriente de fibroblastos embrionários de ratos irradiados (MEF), CF1 tensão, em um poço de uma gelatina revestidos placa de cultura de tecido de 6 bem no meio de cultura MEF (D-MEM suplementado com meio basal 10% inativado pelo calor FBS e 1% não-aminoácidos essenciais). Incubar overnight a 37 ° CO C e 5% _2.
2. Antes de remover as células-tronco embrionárias humanas a partir de nitrogênio líquido, a certeza de ter todos os equipamentos necessários e reagentes no lugar e pronto para uso para assegurar um degelo eficiente e bem sucedida.

Descongelar as células-tronco embrionárias humanas

3. Remover um frasco criogênico de células-tronco embrionárias humanas do tanque de armazenamento de nitrogênio líquido usando uma pinça de metal.
4. Role o frasco entre as mãos enluvadas por 3-5 segundos para remover o gelo.
5. Registrar as informações no rótulo do frasco.
6. Utilizando uma pinça de metal, mergulhe o frasco em banho-maria a 37 ° C. Gire o frasco cuidadosamente e observar a evolução do degelo, muitas vezes (mas rapidamente!), Segurando o frasco contra a luz para ver o tamanho dos cristais de gelo. Não mergulhe a tampa do frasco em banho-maria, pois isso pode contaminar as células.
7. Quando apenas um pequeno cristal de gelo permanece submergir, o frasco inteiro em etanol para esterilizar.
8. Em uma cabine de segurança biológica estéril, transferir o conteúdo do frasco criogênico diretamente para o fundo de um tubo cônico de 15 mL.
9. Lentamente, adicionar 4 mL de meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas (D-MEM/F-12 meio basal suplementado com Knockout substituição de 20% de soro, 1% não-aminoácidos essenciais, de 1% L-glutamina, 0,2% β-mercaptoetanol e 4 ng / mL bFGF) ao tubo. Agite levemente para misturar continuamente as células como o novo meio é adicionado ao tubo.
10. Centrifugar as células por 5 minutos a 200 x g.

Chapeamento as células-tronco embrionárias humanas

11. Enquanto as células-tronco embrionárias humanas são na centrífuga, prepare o prato alimentador MEF pela rotulagem com as informações apropriadas de células-tronco embrionárias humanas: linha celular, o número de passagem, e data de degelo.
12. Quando há cerca de 2 minutos em tempo de rotação, aspirar o meio de cultura MEF e adicionar 1,0 mL de PBS para o bem.
13. Trazer as células-tronco embrionárias humanas peletizadas de volta para o gabinete de segurança biológica e aspirar cuidadosamente o sobrenadante. Tenha cuidado para não aspirar o pellet celular, mas remover o máximo possível sobrenadante, já que esta solução contém DMSO do meio de congelamento.
14. Re-suspender o pellet muito delicadamente, adicionando 2,5 mL de meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas usando uma pipeta de vidro 5 mL e pipetagem 3-4 vezes.
15. Aspirar o PBS a partir do alimentador MEF bem e adicionar lentamente todos os 2,5 mL da suspensão de células-tronco embrionárias humanas para o bem preparados da placa de 6 poços.
16. Coloque a placa no 37 ° C incubadora e deslize com cuidado a placa para a frente para trás, e para os lados para distribuir uniformemente as células ao longo do poço. Não agite a placa em um padrão circular para evitar a concentração de colônias no centro.
17. Permitir que as células para anexar a 37 ° C e 5 CO _2% durante a noite.
18. O dia após o degelo, remova a mídia (com as células flutuante) e adicionar 2,5 ml de meio de cultura fresco CTeh para o bem.
19. Opcional: O meio removido e as células podem ser transferidos para uma placa de alimentação preparada MEF separado. Este passo muitas vezes gera novas colônias que podem ser cultivadas em paralelo com as células do degelo original.
20. Incubar as placas a 37 ° C e 5 CO _2% durante a noite.

2. Congelamento das Células-tronco embrionárias humanas

1. Enquanto as células-tronco embrionárias humanas são na centrífuga, rótulo dos frascos criogênicos dentro do gabinete de segurança biológica, incluindo a linha celular, o número de passagem, e data de congelamento. A densidade típica de células-tronco embrionárias humanas congelamento é um bem de células (a partir de uma placa de 6 poços) por frasco criogênico.
2. Quando as células-tronco embrionárias humanas terminar a centrifugação, os tubos de trazer de volta para o gabinete de segurança biológica. Aspirar o sobrenadante do tubo, tomando cuidado para não perturbar o frouxamente cheia de pellet celular.
3. Ressuspender o pellet celular com a quantidade adequada de meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas: 0,5 mL de cultura de células-tronco embrionárias humanas médio por frasco criogênico. Ser muito gentil quando pipetagem, como as células-tronco embrionárias humanas se recuperar melhor quando congelados em pedaços colônia relativamente grande.
4. Lentamente, enquanto agitando o tubo, adicione a quantidade adequada (0,5 mL por cryovial) de 2X médio congelamento CTeh (60% FBS definido, 20% TEh meio de cultura celular, e 20% DMSO) para as células. Uma vez que o meio de congelamento é adicionado, a solução extremamente pipeta suavemente 1-2 vezes para misturar.
5. Rapidamente mas com cuidado, adicione 1 mL da suspensão de células a cada frasco criogênico.
6. Transferir os frascos em um recipiente de congelamento isopropanol e coloque emum freezer -80 ° C durante a noite. As células irá congelar a 1 ° C por minuto no recipiente de congelamento isopropanol.
7. No dia seguinte, transferir rapidamente os frascos congelados para um tanque de nitrogênio líquido de armazenamento usando uma pinça de metal.

Resultados representante

O primeiro dia depois que as células ES humanas são descongelados, pequenas colônias podem aparecer transparente e pode ser difícil de ver sob o microscópio. Como as células ES recém descongelados lentamente tendem a proliferar, eles podem levar alguns dias para aparecer como colônias estabelecidas (Figura 1).

Figura 1. Recuperação e crescimento das células. Células-tronco embrionárias humanas a partir de descongelado nitrogênio líquido foram fotografadas 1, 7 e 11 dias após o descongelamento.

Discussão

O vídeo que acompanha demonstra um método para descongelar e congelar células-tronco embrionárias humanas. Células congeladas em nitrogênio líquido devem ser descongeladas banho o mais rápido possível para obter a melhor recuperação possível. Lembre-se de ser extremamente cuidadoso ao pipetar células descongelamento: minimizar o manuseio das células e pipeta suavemente. Um frasco de células-tronco embrionárias humanas podem ser semeados em qualquer um poço de uma placa 6-bem, ou todos os poços de uma placa de 4 bem e imediatamente colocado na incubadora. Uma vez que o cultivo em quatro poços separados reduz a possibilidade de perder toda a cultura à contaminação, e torna mais fácil para localizar as colônias de células-tronco embrionárias humanas na superfície menor, a placa de 4 bem é recomendado quando o descongelamento de células-tronco embrionárias humanas, pela primeira vez.

O primeiro dia após o descongelamento de células-tronco embrionárias humanas, as colónias são pequenas e podem ser transparentes. Reabastecer o meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas a cada dia, mesmo que as colônias não são aparentes sob o microscópio, pois pode levar alguns dias em cultura de células-tronco embrionárias humanas para aparecer como colônias estabelecidas. É importante usar uma camada de alimentador de recém-banhado MEF quando descongelar as células, como as colônias muitas vezes não chegar a um tamanho adequado para até 10 passaging 12 dias após o degelo.

Quando descongelar um frasco de passagem baixa de células-tronco embrionárias humanas, é uma boa prática para expandir e congelar os frascos adicionais para manter um estoque de células passagem baixa para a cultura e as experiências futuras. Também é uma boa idéia rotineiramente congelar todos os "extras" células-tronco embrionárias humanas saudáveis ​​para manter estoques congelados. O degelo de maior sucesso e culturas subseqüentes foram congelados de alta qualidade, indiferenciado, colônias de células-tronco embrionárias humanas dividindo ativamente. células-tronco embrionárias humanas se recuperar de um congelamento de forma mais eficiente se for manuseada com cuidado como agregados maiores celular. O tamanho final global deve ser semelhante (ou ligeiramente maior do que) o tamanho dos agregados banhado depois de uma passagem de rotina.

Materiais

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
D-MEM		Invitrogen	11965-092	For MEF mediumjavascript:void(0);
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified		Invitrogen	16000-044	Heat-inactivated For MEF medium
D-MEM/F-12		Invitrogen	11330-057
Knockout Serum Replacement		Invitrogen	10828-028	Pre-screen to ensure support of hES cells
bFGF		Stemgent	03-0002	Use at [4 ng/mL] final
Non-essential Amino Acids		Invitrogen	11140-050
L-glutamine		Invitrogen	25030-081	200 mM (100X) Use at [1X] final
PBS		Invitrogen	14190-250	Without Ca2+ or Mg2+
Collagenase IV		Invitrogen	17104-019	Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12
Gelatin		Sigma	G1890	Type A, Porcine
DMSO		Sigma	D2560	For freezing medium
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined		HyClone	SH300.70.01	For freezing medium
6-well plates		Nunc	140675	For general culture
4-well plates		Nunc	176740	For thawing
5 mL glass pipettes		Fisher	13-678-27E	Individually wrapped
15 mL conical tubes		Corning	430052	Polypropylene
Cryogenic vials		Nunc	5000-1020	1.5 mL capacity
Freezing container		Nalgene	5100-0001	“Mr. Frosty”