Dissection של 6.5 עוברים DPC עכבר

Summary

בידוד של postimplantation בשלב עוברי מאפשר ללמוד דפוסים גן ולנתח התא השושלת תהליכי קבלת ההחלטות במהלך ההתפתחות העוברית, אבל לנתיחה תקין של העובר מוקדם יכול להיות מאתגר. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד מוקדם פס פרימיטיבי, בשלב עוברי (~ 6.5 ימים הודעה coitum [DPC]).

Abstract

ניתוח דפוסי ביטוי גנים במהלך השלבים המוקדמים של ההתפתחות העוברית יונקים יכולים לספק רמזים חשובים על תפקוד אינטראקציה גן תאים תאים, מנגנוני איתות כי דפוסים מדריך עובריים. עם זאת, דיסקציה של העובר עכבר decidua זמן קצר אחרי ההשתלה יכול להיות הליך מאתגר, ותיעוד מפורט צעד אחר צעד של תהליך זה הוא חסר.

כאן אנו מדגימים כיצד שלאחר ההשתלה (6.5 DPC) עוברים מבודדים תחילה לנתח את הרחם של עכבר בהריון (זיהוי של coitum את התקע הנרתיק יועד 0.5 poist יום) ולאחר מכן לנתח את העובר מן decidua אימהית. דיסקציה של הממברנה של רייכרט מתואר כמו גם הסרה של חרוט ectoplacental.

Protocol

Dissection של איברי הרבייה של העכבר נקבה

1. חיות בהריון מומתים בחנק CO ₂ באמצעות גז דחוס.
2. הנח את פרקדן בעלי חיים על משטח סופג ולטבול אותו אתנול 70% כדי להפחית את הסיכון של זיהום דיסקציה עם שיער העכבר.
3. לצבוט את העור לעשות חתך לרוחב קטן קו האמצע עם מספריים כירורגי רגיל. מתחי את העור היטב מעל ומתחת החתך ומושכים את העור כלפי חוץ הראש והזנב לחשוף את הבטן.
4. אחוז הצפק עם מלקחיים ולחתוך לחשוף את חלל הבטן.
5. אתר את איברי הרבייה באזור הגבי של חלל הגוף: שתי קרניים הרחם, oviduct ואת השחלות.

Streak בשלב פרימיטיבי (6.5 DPC) Dissection

1. הסר את קרן הרחם ידי אחיזה הרחם להלן oviduct ופצע אותו בחינם יחד mesometrium. המקום הרחם גזור בקרח קר PBS.
   
   
   
   איור 1
   
   
2. הפרד העובר על ידי חיתוך בין אתרים ההשתלה יחד קרן הרחם.
   
   
   
   איור 2
   
   
   
3. תפוס את רירית הרחם שרירים ידי הזזה מלקחיים של שען בין שכבת השריר שמסביב רקמת decidua אפוף. מקלפים את שכבת השריר האחורי, חשיפת decidua.
   
   
   
   איור 3
   
   
4. קליפ את חלק decidua נחשף בפסגת (כ 1 / 5 של הרקמה decidua) אשר יחשוף את קצה midventral או דיסטלי של העובר סגורה.
   
   
   
   איור 4
   
   
5. העובר יכול להיות הפגיזו מחוץ באמצעות קצות מלקחיים. פירס decidua עם מלקחיים המקיפים את העובר ואת מלקחיים לפתוח decidua לקרוע לגזרים.
   
   
   
   איור 5
   
   
6. לאחר העובר מוסר, קרום של רייכרט, עדיין עשויים להיות מצורפים, כמו גם חרוט ectoplacental (trophoblast). העובר יכול להיות גזור נוספת על ידי דיסקציה זהירה.
   
   
   איור 6
   

Discussion

Postimplantation בעכבר מתרחשת בין 4.5 DPC והלידה. שיטה זו דיסקציה יכול להיות מיושם, למעשה כמתואר, כדי לבודד מוקדם או מאוחר יותר עוברים לשלב ב 5.5-8.5 DPC.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Forceps serrated, straight	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5130	2 pairs
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010	2 pairs
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x)	Reagent	Invitrogen	14190
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-757-12
4% Paraformaldehyde in PBS	Reagent
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Tool	Fisher Scientific	08-940
Pregnant female mice	Animal
Dissecting Microscope	Microscope