6.5 DPC Fare Embriyolar diseksiyonu

Özet

Postimplantation-dönem embriyoların İzolasyon bir gen desenlendirme hücre soy karar verme süreçlerini embriyonik gelişim sırasında çalışma ve analiz etmek için izin verir, fakat erken embriyo uygun diseksiyonu zor olabilir. Bu protokol erken ilkel bir çizgi-dönem embriyoların izole etmek için bir yöntem açıklanır (~ 6.5 gün coitum [DPC).

Özet

Memeli embriyonik gelişimin erken aşamalarında gen ekspresyonu analizi, gen fonksiyonu, hücre-hücre etkileşimi ve sinyal mekanizmaları bu kılavuzu embriyonik desenlendirme hakkında önemli ipuçları sağlayabilir. Ancak, fare embriyo implantasyonu kısa bir süre sonra desidua diseksiyonu zor bir işlem olabilir ve bu sürecin ayrıntılı adım-adım belgelerine eksiktir.

Burada ilk kez hamile bir fare rahim diseksiyon (vajinal fiş belirlenen gün 0.5 poist coitum tespit) ve daha sonra embriyonun anne desidua diseksiyon post-implantasyon (6.5 DPC) embriyolar nasıl izole edilir göstermektedir. Reichert membran diseksiyonu ectoplacental koni kaldırılması yanı sıra açıklanmıştır.

Protokol

Bir dişi fare üreme organları diseksiyonu

1. Gebe hayvanlar sıkıştırılmış gaz kullanarak CO ₂ boğulma tarafından ötenazi.
2. Emici ped hayvan yatar Lay ve fare saç diseksiyonu kontamine riskini azaltmak için% 70 etanol içinde bekletin.
3. Cilt sıkın ve düzenli cerrahi makas ile orta hatta küçük bir yatay kesi yapmak. Sağlam bir şekilde yukarıdan ve kesi altında tutun ve cilt cilt dışında karın ortaya çıkarmak için baş ve kuyruk doğru çekin.
4. Forseps ile tutun ve periton karın boşluğunda ortaya çıkarmak için kesilmiş.
5. Iki, rahim boynuzları, yumurtalık ve yumurtalıkların: vücut boşluğuna dorsal bölgedeki üreme organları bulun.

İlkel Streak aşamalı (6.5 DPC) Diseksiyon

1. Uterin horn rahim yumurtalık altında tutarak çıkarın ve mesometrium boyunca ücretsiz kesmek. Buz PBS disseke rahim yerleştirin.
   
   
   
   Şekil 1
   
   
2. Her embriyo rahim boynuz boyunca implantasyon siteler arasında keserek ayırın.
   
   
   
   Şekil 2
   
   
   
3. Saatçilik forseps çevresindeki kas tabakası ve zarflı desidua dokusu arasında kaydırarak kas rahim astar kavrayın. Peel, geri kas tabakası desidua ortaya.
   
   
   
   Şekil 3
   
   
4. Midventral veya distal ucu kapalı embriyo gösterecektir apeks (yaklaşık 1 / 5 desidua dokusu) maruz kalan desidua bir kısmını off klibi.
   
   
   
   Şekil 4
   
   
5. Forseps ve ipuçlarını kullanarak embriyo kabuklu olabilir. Pierce, forseps ve embriyo çevreleyen açık forseps ile desidua dışında desidua gözyaşı.
   
   
   
   Şekil 5
   
   
6. Bir kez embriyo kaldırılır, Reichart membran hala ectoplacental konisi (trofoblast) olarak de bağlı olabilir. Embriyo daha dikkatli diseksiyon ile disseke edilebilir.
   
   
   Şekil 6
   

Tartışmalar

Fare Postimplantation 4,5 DPC ve doğum arasında oluşur. Bu diseksiyon yöntemi olarak tanımlanan, aslında, önceki veya sonraki 5,5-8,5 DPC sahne embriyolar izole etmek için uygulanabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro Dissecting Forceps serrated, straight	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5130	2 pairs
Micro Dissecting Tweezers Pattern #55 INOX	Tool	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010	2 pairs
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1x)	Reagent	Invitrogen	14190
Fisherbrand Sterile Polysytrene Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-757-12
4% Paraformaldehyde in PBS	Reagent
Straight Sharp-Pointed Dissecting Scissors	Tool	Fisher Scientific	08-940
Pregnant female mice	Animal
Dissecting Microscope	Microscope