גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

Summary

זה פרוטוקול הפרטים גזירת להשתלה בתאי גזע hematopoietic מתאי גזע עובריים של עכבר (ESC) הזרקת הבאים שלהם לעכברים הנמען מוקרן קטלנית. בקצרה, הם ESC להבדיל גופים embryoid, אשר נגועים אז עם HoxB4 retroviral ושיתוף תרבותי עם OP9 תאים סטרומה וציטוקינים hematopoietic.

Abstract

תא גזע מוגדר בתא עם היכולת הן עצמית לחדש וליצור בידול צאצאים מרובים. לתאי גזע עובריים (ESC) נגזרות הבלסטוציסט העובר מוקדם הם pluripotent ביכולת differentiative. פוטנציאל עצום differentiative שלהם הפכה אותם למוקד של מחקר רב התרכזו והסיק איך לפתות אותם כדי לייצר תאים מסוגים שימושי קלינית. גזרה מוצלחת של בתאי גזע hematopoietic (HSC) מהעכבר ESC לאחרונה הושג וניתן דמיינו בפרוטוקול הווידאו הזאת. HSC, ניתן לטעון את האוכלוסייה תא ביותר לנצל קלינית, משמשות לטיפול מספר עצום של ממאירויות והפרעות hematopoietic. עם זאת, חולים רבים שעשויים להפיק תועלת מטיפול HSC חוסר גישה תורמים מתאימים. ESC יכול לספק מקור חלופי של HSC עבור חולים אלו. פרוטוקול הבאה קובעת הבסיס שממנו ESC-HSC ניתן ללמוד ולהודיע ​​המאמצים לבודד HSC מ ESC האדם. בפרוטוקול זה, ESC הם להבדיל גופים embryoid (EBS) במשך 6 ימים בידול זמינים מסחרית מראש לגילוי נסיוב hematopoietic אופטימלית. EBS הם ניתק אז נגוע HoxB4 retroviral. אינפקטד EB-derived תאים מצופה על OP9 stroma, מח עצם קו סטרומה תא נגזר מכסה הגולגולת של M-CSF-/ - עכברים, ושיתוף בתרבית בנוכחות hematopoiesis קידום ציטוקינים למשך עשרה ימים. במהלך תרבות משותפת זו, תאים נגועים להרחיב באופן משמעותי, וכתוצאה מכך הדור בריכה הטרוגנית של 100s של מיליוני תאים. תאים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי עכברים הצלה מחדש מוקרן קטלנית.

Protocol

התמיינות של תאים עובריים

1. איסוף בקבוקון ומחוברות ליד של תאים עובריים (ESC) דרך הטיפול עם טריפסין ESC.
2. Resuspend תאים 5 מ"ל של התקשורת גזירה להעביר שאינו מצופה ג'לטין T25. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. אחזר supernatant לאסוף תאים באמצעות צנטריפוגה.
   
   הערה: fibroblasts עכבר עובריים (MEFs) מן התרבויות ESC לצרף בקלות הלא מצופה ג'לטין T25 ובכך מתרוקנים מתרבות במהלך שלב זה ציפוי. אם אתה לא culturing ESC על MEFs, אתה יכול לדלג על צלחת מראש.
   
   
3. Resuspend-MEF מדולדל ESC בתקשורת בידול בכל מ"ל cells/50 333,333. ריכוז התוצאה ESC/15 100 מ"ל.
4. שימוש רב ערוצי pipettor, צלחת ESC על ירידה cells/15 100 מ"ל ב -15 ס"מ ² צלחות פטרי. Pipettor עם 8 ערוצים, אתה אמור להיות מסוגל להתאים על 18-22 שורות של טיפות לכל צלחת (כ 5 מ"ל לכל צלחת).
   
   הערה: לקבלת הפרוטוקול הזה, 2-5 15 ס"מ ² מנות של טיפות יהיה יותר מהדרוש ויש תשואה 2-5 x 10 ⁶ ששת הימים EB-derived תאים.
   
   
5. בעדינות להעיף צלחות כדי להפוך טיפות. לדגור על 37 ° C 5% CO ₂ למשך 48 שעות.
6. בריכת טיפות ידי בעדינות מתערבל צלחות להעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. לשטוף צלחות עם 4-6 מ"ל של PBS ולהוסיף אותו 15 מ"ל חרוטי.
   
   הערה: ייתכן הבריכה עד חמש צלחות ירידה תלוי. EBS יגדל כפי שהם ממשיכים להבדיל אם הם מרוכזים מדי והם נוטים ליצור גושים גדולים.
   
   
7. אפשר EBS ונקווה להתיישב על ידי כוח הכבידה (כ -10 דקות). לשאוב supernatant מבלי להפריע EBS. Resuspend בעדינות 10 מ"ל בידול התקשורת והעברת עד 10 צלחת לא חסיד ס"מ פטרי.
8. מניחים צלחת על צלחת פטרי שייקר בסל"ד 50 ו לדגור על 37 ° C 5% CO _2.
9. 24 שעות לאחר מכן (יום ארבעה בידול), צלחות מערבולת להתרכז EBS במרכז של צלחת פטרי. בזהירות להחליף 50% לתקשורת (5 מ"ל) עם 5 מ"ל מדיה בידול טריים. חזור אל צלחת החממה במשך יומיים נוספים.

EB דיסוציאציה וזיהום עם MSCV-HoxB4-IRES-GFP

1. ביום שישה בידול, העברת EBS על צינור 15 מ"ל חרוטי. אפשר להתיישב על ידי כוח הכבידה.
2. לשאוב מדיה resuspend ב 10 מ"ל PBS. EBS אפשר ליישב על ידי כוח הכבידה. לשאוב PBS.
3. מוסיפים 250 מ"ל לערבב דיסוציאציה האנזים 1 מ"ל PBS. דגירה באמבט מים C ° 37 במשך 20 דקות, לפעמים מתערבל צינור לערבב אנזימים EBS.
4. הוסף חוצץ 8 מ"ל אנזים ללא ניתוק.
5. Triturate התערובת בעזרת פיפטה 5 מ"ל עד EBS הם מנותקים לחלוטין (בערך 10 פעמים; pipetting מופרז תגדיל את מותו בתוך בהכנת-EB נגזר התא).
   1. תערובת יהיה מעונן עם תאים כמו EBS לנתק.
   2. הנחת קצה פיפטה נגד התחתון של צינור חרוטי במהלך טחינה דקה תיצור כוח גזירה כי יהיה מאוד להקל על ניתוק.
6. איסוף תאים באמצעות צנטריפוגה.
7. Resuspend EB-derived תאים 5 מ"ל של IMDM 10% מהסכום באמצעות הרחקה trypan כחול
   
   הערה: בין יום לארבעה ימים שישה בידול, EBS למער שתוצאתה כמות גדולה של אפופטוזיס ו death.Thus התא, ביום השישי, למעלה מ -30% EB-derived תאים עשויים כתם כחול עם trypan.
   
   
8. תאים Resuspend EB-נגזרת ב 100,000 תאים / 2 מ"ל של 10% + IMDM ויראלי supernatant כזה משרד הפנים של 50-10 הוא achieved.Add סולפט protamine לריכוז סופי של 8 מ"ג / מ"ל.
   
   הערה: הכן EB מספיק / לערבב supernatant ויראלי לצלחת ארבע צלחות 6-היטב (בהנחה 2 mL / טוב).
   
   
9. פלייט 2 מ"ל EB / לערבב היטב לכל supernatant ויראלי של ארבע 6 צלחות היטב מראש מצופה OP9 תאים stroma (ראה להלן).
10. צנטריפוגה צלחות ב 2500 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 90 דקות. העברת צלחות החממה ב 37 ° C 5% CO _2.
11. 4-6 שעות לאחר מכן, מסיק supernatant מתוך צלחות לאסוף את כל התאים הנותרים פוטנציאל ההשעיה באמצעות צנטריפוגה.
12. Resuspend גלולה (עשוי להיות קטן) ב IMDM מ"ל 48 10% + ציטוקינים. לוותר על 2 מ"ל / היטב resuspension המקורי four-6 גם צלחות שבו זיהום בוצע supernatant נאסף.
    
    הערה: תמיד להכין 10% IMDM + ציטוקינים טרי בזמן השימוש.
    
    
13. דגירה צלחות ב 37 ° C 5% CO ₂ למשך שבעה ימים. מושבות צריכה להיות ברורה על ידי זיהום four שלאחר יום גדול בנוי היטב על ידי שבעה ימים. הרחבת חזקים צריכים להניב 40-60 מושבות / גם ביום שבע.
14. על שבעה זיהום שלאחר יום, לאסוף בריכת כל התאים (כולל OP9 stroma) מבארות כל ידי טיפול עם טריפסין.
    
    הערה: אין להשליך supernatant או PBS שוטף המועסקים במהלך טריפסין treatment.At הנקודה הזו בתרבות, מושבות מסוימים עשויים להיות חסיד רק באופן רופף ויש תאים רבים floaהטבעת suspension.Collect ובריכת כל מתרחץ supernatant על מנת להבטיח כי לא התאים ערך פוטנציאלי מבוטלים.
    
    
15. תאים Resuspend ב IMDM 8 מ"ל טרי 10% + ציטוקינים. הפץ 2 MLS / בקבוקון לארבע צלוחיות T75. הוסף נוספת 13 MLS 10% + ציטוקינים IMDM אל בקבוק אחד. לדגור על 37 ° C 5% CO ₂ למשך שלושה ימים (סה"כ עשרה ימים של זיהום הודעה).

התרבות ציפוי של OP9 stroma

1. שמור OP9 stroma פי פרוטוקולים סטנדרטיים ב 20%, ממ. OP9 התאים יהיה לשנות את מאפייני כאשר גדלה confluency. לפצל תמיד ב 80% confluency על הפיצול לא יותר מ 01:03.
2. 24 שעות לפני ההדבקה של שישה יום EB-derived תאים עם MSCV-HoxB4-IRES-GFP, צלחת 25,000 OP9 תאים / טוב של ארבעה 6 צלחות גם 20% מ-.

, אוסף חלוקה והשתלות

1. איסוף תאים מורחבת על stroma OP9 עשרה ימים באמצעות טיפול עם טריפסין. ספירת תאים.
   
   הערה: אין להשליך supernatant או PBS שוטף המועסקים במהלך הטיפול טריפסין. בשלב זה בתרבות, מושבות מסוימים עשויים להיות חסיד רק באופן רופף ויש תאים רבים צפים suspension.Collect ובריכת כל מתרחץ supernatant על ​​מנת להבטיח כי לא התאים ערך פוטנציאלי מבוטלים.
   
   הערה: הרחבה טוב צריך התשואות בין 40-50 x 10 ⁶ תאים / צלחת המקורי 6-גם נגוע, עבור סכום כולל של 160-200 x 10 ⁶ תאים.
   
   
2. תאים עשויים להיות מופרדים באמצעות מבחר חרוז או FACS מגנטי על פי טכניקות סטנדרטיות בשלב זה בפרוטוקול.
3. להשתלה, לספק תאים באמצעות רטרו מסלולית או הזרקה לווריד הזנב לנמענים לקוי Rag-2/gc (במשקל בין 15-22 גרם) נתון מנה פיצול של 9.25 gy של 2.5 שעות הקרנה. בנפרד.
   
   הערה: זה קריטי, כי המשקל של בעלי החיים ליפול בין 15-22 גרם בזמן של קרינה. אם הם גדולים יותר מאשר 22 גרם, 9.25 gy לא יהיה מנה מספקת של הקרנה, כדי להבטיח את אבלציה המתאימים תאים לא יכול לתווך להציל הקרנה קטלנית ו / או נקלטים תא hematopoietic. אם השתלת בעלי חיים גדולים יותר, במינון קרינה המתאים צריכה להיקבע באופן ניסיוני.
   
   
4. מינון מינימלי של 2-5 x 10 ⁶ תאים / החי נדרשת ערבות להציל הקרנה קטלנית. אם fractionating התאים, להזריק 2-5 x 10 ⁶ ושווי התא (לדוגמא, אם האוכלוסייה עניין מייצג 10% בריכת unfractionated של תאים, להזריק 2-5 x 10 ⁵ תאים / בעלי חיים).
   
   הערה: אם הזרקת> 2 x 10 ⁶ תאים, תמיד מזריקים דרך וריד הזנב, כדי למנוע היווצרות תפלצת במסלול, אשר עלול לגרום כאשר מספר רב של תאים מועברות בסגנון רטרו orbitally.
   
   
5. שמור על סמרטוט-2 ^{- / -} / GC ^{- / -} מקבלי לקוי בכלובים autoclaved. בהתאם "ניקיון" של המתקן החי, השתלת פוסט חיות עשויים לדרוש הממשל מים acidified או Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) במשך 5 שבועות לאחר קרינה קטלנית.
   
6. צפו> GFP 90% + ES-derived לויקוציטים בדם ההיקפי בבית 3 שבועות לאחר ההשתלה. Engraftment צריך להיות רב השושלת, למרות לימפוציטים ידועים שתיקה retroviral HoxB4-IRES-GFP.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc