Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

Riepilogo

Questa dettagli del protocollo la derivazione di cellule staminali ematopoietiche trapiantabili da topo cellule staminali embrionali (ESC) e la loro successiva iniezione in topi irradiati letalmente destinatario. In breve, ESC si differenziano come corpi embrionali, che sono poi infettati con HoxB4 retrovirali e co-coltura con cellule stromali OP9 e citochine ematopoietiche.

Abstract

Una cellula staminale è definito come una cella con la capacità di entrambe le auto-rinnovarsi e di generare più progenie differenziata. Le cellule staminali embrionali (ESC) sono derivate dalla blastocisti dell'embrione precoce e sono pluripotenti in grado differenziativo. Il loro potenziale differenziativo vasta li ha resi oggetto di ricerche molto centrata sulla dedurre il modo di convincere loro di generare tipi di cellule clinicamente utili. La derivazione di successo di cellule staminali ematopoietiche (HSC) da topo CES è stato recentemente compiuto e possono essere visualizzati in questo protocollo video. HSC, probabilmente la popolazione di cellule clinicamente più sfruttati, sono usati per trattare una miriade di tumori ematopoietici e disturbi. Tuttavia, molti pazienti che potrebbero trarre beneficio dalla terapia HSC non hanno accesso ai donatori idonei. ESC potrebbe fornire una fonte alternativa di HSC per questi pazienti. Il seguente protocollo stabilisce una linea di base da cui ESC-HSC possono essere studiati e informare gli sforzi per isolare da HSC umane ESC. In questo protocollo, ESC si differenziano come corpi embrionali (EBS) per 6 giorni nel commercio sierici pre-screening per la differenziazione ottimale ematopoietiche. EBS sono dissociati e poi infettati con HoxB4 retrovirali. Infetti EB cellule derivate sono placcati in OP9 stroma, un stromali del midollo osseo linea cellulare deriva dalla calvaria di M-CSF-/ - topi, e co-coltura in presenza di ematopoiesi promuovere citochine per dieci giorni. Durante questo co-coltura, le cellule infette espandere notevolmente e si traducono nella generazione un pool eterogeneo di 100s di milioni di cellule. Queste cellule possono quindi essere utilizzati per topi salvataggio e ricostituire letale irradiati.

Protocollo

Differenziazione delle cellule staminali embrionali

1. Raccogliere un pallone vicino confluenti di cellule staminali embrionali (ESC) tramite trattamento con tripsina ESC.
2. Risospendere le cellule in 5 ml di mezzi di differenziazione e trasferimento in un non-gelatina rivestito T25. Incubare a 37 ° C per 45 minuti. Recuperare il surnatante e raccogliere le cellule tramite centrifugazione.
   
   Nota: fibroblasti embrionali di topo (MEF) dalle culture CES collegare facilmente al non-gelatina rivestito T25 e quindi sono esaurite dalla cultura in questa fase placcatura. Se non sei coltura tuo ESC MEF, è possibile saltare il pre-piastra.
   
   
3. Risospendere MEF-CES impoverito nei media differenziazione a 333.333 cells/50 ml. Questa concentrazione si traduce in 100 ESC/15 ml.
4. Utilizzando pipettatore multicanale, piastra CES a 100 mL cells/15 caduta il 15 cm ² piastre Petri. Con una pipetta a 8 canali, si dovrebbe essere in grado di adattarsi circa 18-22 righe di gocce al piatto (circa 5 ml per piastra).
   
   Nota: per questo protocollo, 2-5 15 cm ² piatti di gocce sarà più che sufficiente e deve cedere 2-5 x 10 ⁶ sei giorni EB cellule derivate.
   
   
5. Delicatamente capovolgere le piastre per invertire gocce. Incubare a 37 ° C 5% CO ₂ per 48 ore.
6. Piscina scende di rimestando delicatamente piatti e trasferimento a 15 ml tubo conico. Lavare piatti con 4-6 ml di PBS e aggiungere 15 ml conica stessa.
   
   Nota: è possibile piscina fino a cinque piatti goccia pendente. L'EBS crescerà che continuano a differenziare e se sono troppo concentrati tendono a formare grumi di grandi dimensioni.
   
   
7. Lasciare in pool EB di risolvere per gravità (circa 10 minuti). Aspirare il surnatante senza disturbare EBS. Risospendere delicatamente in media 10 ml Differenziazione e trasferimento a 10 cm non aderente piastra di Petri.
8. Inserire la piastra di Petri con agitazione a 50 rpm e incubare a 37 ° C al 5% di CO _2.
9. 24 ore più tardi (quattro giorni di differenziazione), piatti vortice di concentrarsi EB nel centro della capsula di Petri. Accuratamente lo scambio del 50% di media (5 ml) con 5 supporti mL Differenziazione fresca. Ritorna alla piastra incubatore per altri due giorni.

EB dissociazione e l'infezione con MSCV-HoxB4-IRES-GFP

1. Il giorno sei di differenziazione, il trasferimento di EB a 15 ml tubo conico. Lasciar riposare per gravità.
2. Aspirare media e risospendere in 10 ml di PBS. Lasciare EBS per reinsediare per gravità. Aspirare il PBS.
3. Aggiungere 250 ml di miscela di enzimi dissociazione e 1 ml di PBS. Incubare a 37 ° C acqua bagno per 20 minuti, a volte vorticoso tubo di mescolare enzimi e EBS.
4. Aggiungere 8 ml di enzima senza buffer di dissociazione.
5. Triturare miscela utilizzando pipetta da 5 ml fino EB sono completamente dissociati (circa 10 volte; pipettaggio eccessiva aumenterà la morte entro il EB-derivati ​​preparazione delle cellule).
   1. Miscela diventerà nuvoloso con cellule come EB dissociano.
   2. Posizionamento puntale contro la parte inferiore del tubo conico durante la triturazione creerà una forza di taglio che agevolerà notevolmente dissociazione.
6. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione.
7. Risospendere EB cellule derivate in 5 ml di 10% IMDM e contare con esclusione blu trypan
   
   Nota: Tra quattro giorni e sei giorni di differenziazione, EBS cavitazione che si traduce in una grande quantità di apoptosi e death.Thus cellulare, a sei giorni, verso l'alto di 30% di EB cellule derivate possono macchiare con trypan blu.
   
   
8. Risospendere le cellule EB-derivati ​​a 100.000 cellule / 2 ml di 10% + IMDM virale surnatante tale che un MOI di 5-10 è achieved.Add solfato di protamina per una concentrazione finale di 8 mg / mL.
   
   Nota: Preparare EB abbastanza / virale mix surnatante alla piastra quattro piastre 6-bene (assumendo 2 ml / pozzetto).
   
   
9. Tavola 2 ml EB / virale mix surnatante per pozzetto di quattro 6 piatti ben pre-placcato con OP9 cellule stroma (vedi sotto).
10. Centrifugare piastre a 2500 rpm a temperatura ambiente per 90 minuti. Trasferire le piastre a incubatore a 37 ° C al 5% di CO _2.
11. 4-6 ore più tardi, raccolta surnatante dai piatti e raccogliere tutte le cellule potenziale residuo in sospensione tramite centrifugazione.
12. Risospendere il pellet (può essere di piccole dimensioni) in 48 mL IMDM 10% + citochine. Dispensare 2 ml / pozzetto di risospensione di originale in quattro a 6 pozzetti in cui è stata effettuata l'infezione ed un surnatante è stato raccolto.
    
    Nota: Sempre preparare 10% IMDM + citochine fresco al momento dell'uso.
    
    
13. Incubare le piastre a 37 ° C al 5% di CO ₂ per sette giorni. Colonie dovrebbe essere evidente da quattro giorni dopo l'infezione e di grandi dimensioni e ben formato da sette giorni. Una vigorosa espansione dovrebbe produrre 40-60 colonie / e il giorno sette.
14. Su sette giorni dopo l'infezione, raccogliere e piscina tutte le cellule (comprese OP9 stroma) da tutti i pozzetti di trattamento con tripsina.
    
    Nota: NON surnatante o PBS lava impiegati durante tripsina treatment.At questo punto della cultura, alcune colonie possono essere solo vagamente aderente e ci sono molte cellule floaTing in suspension.Collect e piscina tutti i lavaggi e surnatante per garantire che non le cellule potenzialmente preziose vengono scartati.
    
    
15. Risospendere le cellule in 8 IMDM mL fresco del 10% + citochine. Distribuire 2 ml / fiasco in quattro T75 fiaschi. Aggiungere ulteriori 13 ml + 10% citochine IMDM ad ogni pallone. Incubare a 37 ° C al 5% di CO ₂ per tre giorni (un totale di dieci giorni dall'infezione).

Cultura e placcatura di OP9 stroma

1. Mantenere OP9 stroma secondo protocolli standard nel 20% a-MEM. OP9 cellule cambierà proprietà quando cresciuto fino a confluenza. Dividi sempre al 80% confluenza a non più di 1:03 split.
2. 24 ore prima infezione di sei giorni EB cellule derivate con MSCV-HoxB4-IRES-GFP, piastra OP9 25.000 cellule / pozzetto di quattro-sei pozzetti nel 20% a-MEM.

Raccolta, il frazionamento e il trapianto

1. Raccogliere le cellule espanse su OP9 stroma per dieci giorni attraverso il trattamento con tripsina. Contare le celle.
   
   Nota: NON surnatante o PBS lava impiegata durante il trattamento con tripsina. A questo punto, nella cultura, alcune colonie possono essere solo vagamente aderente e ci sono molte cellule galleggianti in suspension.Collect e piscina tutti i lavaggi e surnatante per garantire che non le cellule potenzialmente preziose vengono scartati.
   
   Nota: Una buona espansione dovrebbe produrre tra i 40-50 x 10 ⁶ cellule / originale a 6 pozzetti infetti, per un totale di 160-200 x 10 ⁶ cellule.
   
   
2. Cellule possono essere frazionate tramite magnetico selezione tallone o FACS secondo tecniche standard, a questo punto nel protocollo.
3. Per il trapianto, le cellule fornire via retro-orbitale o iniezione vena della coda per Rag-2/gc destinatari carenti (peso compreso tra 15-22 grammi), sottoposti ad una dose di scissione di 9,25 Gy di irradiazione 2,5 ore. a parte.
   
   Nota: è fondamentale che il peso degli animali compresi tra 15-22 grammi al momento della irradiazione. Se sono più grandi di 22 grammi, 9,25 Gy non sarà sufficiente una dose di irradiazione per garantire la ablazione appropriati e le cellule non possono mediare salvataggio da irradiazione letale e / o innestare il comparto ematopoietico. Se il trapianto di grandi animali, la dose di irradiazione appropriati devono essere determinati sperimentalmente.
   
   
4. Una dose minima di 2-5 x 10 ⁶ cellule / animale è tenuto a garantire soccorso da irradiazione letale. In caso di frazionamento delle cellule, iniettare 2-5 x 10 ⁶ cellule equivalenti (ad esempio se la popolazione di interesse rappresenta il 10% del pool di cellule non frazionata, iniettare 2-5 x 10 ⁵ cellule / animale).
   
   Nota: Se l'iniezione> 2 x 10 ⁶ cellule, SEMPRE iniettare via vena della coda per evitare la formazione di teratoma in orbita, che possono risultare quando un numero elevato di cellule vengono consegnati retro-orbitali.
   
   
5. Mantenere Rag-2 ^{- / - /} gc ^{- / -} destinatari carente in gabbie in autoclave. A seconda della "pulizia" della struttura animale, post-trapianto gli animali possono richiedere la somministrazione di acqua acidificata o Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) per le 5 settimane successive radiazioni letali.
   
6. Aspettatevi> GFP 90% + ES-derivati ​​leucociti nel sangue periferico a 3 settimane dopo il trapianto. Attecchimento deve essere multi-lignaggio, anche se i linfociti sono noti al silenzio retrovirali HoxB4-IRES-GFP.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc