Dérivation de cellules souches hématopoïétiques de cellules souches embryonnaires murines

Résumé

Ce protocole décrit la dérivation de cellules souches hématopoïétiques transplantables à partir des cellules souches embryonnaires de souris (CES) et leur injection ultérieure dans des souris irradiées de façon létale bénéficiaires. Brièvement, l'ESC sont différenciées comme des corps embryoïdes, qui sont ensuite infectées par HOXB4 rétroviraux et co-cultivées avec des cellules stromales et OP9 cytokines hématopoïétiques.

Résumé

Une cellule souche est définie comme une cellule avec la capacité à la fois à l'auto-renouvellement et de générer de multiples descendance différenciée. Les cellules souches embryonnaires (CSE) sont dérivées de la blastocyste de l'embryon précoce et sont pluripotentes dans la capacité de différenciation. Leur potentiel de différenciation majorité en a fait l'objet de nombreuses recherches centrées sur la façon de les déduire coaxial pour générer des types cellulaires cliniquement utiles. La dérivation réussie de cellules souches hématopoïétiques (CSH) de la souris ESC a récemment été accompli et peuvent être visualisées dans ce protocole vidéo. HSC, sans doute la population cellulaire la plus cliniquement exploitées, sont utilisés pour traiter une multitude de cancers hématopoïétiques et troubles. Toutefois, de nombreux patients qui pourraient bénéficier d'un traitement HSC n'ont pas accès aux bailleurs de fonds appropriés. ESC pourrait fournir une source alternative de HSC pour ces patients. Le protocole suivant établit une base à partir desquelles l'ESC-HSC peuvent être étudiés et les efforts visant à isoler les CSH de CSE humaines. Dans ce protocole, l'ESC sont différenciées comme des corps embryoïdes (EBS) pour 6 jours dans le sérum disponible dans le commerce présélectionnés pour la différenciation hématopoïétique optimale. EB sont alors dissociées et infectés par HOXB4 rétroviraux. Infected EB cellules dérivées sont étalées sur OP9 stroma de la moelle osseuse de cellules stromales dérivées de la ligne de la calvaria de M-CSF / - souris, et co-cultivées en présence de l'hématopoïèse promotion des cytokines pendant dix jours. Lors de cette co-culture, les cellules infectées connaissent une forte expansion, ce qui entraîne la génération d'une piscine hétérogène de 100s de millions de cellules. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées à des souris de sauvetage et de reconstituer une irradiation létale.

Protocole

Différenciation des cellules souches embryonnaires

1. Recueillir un flacon à proximité de confluence des cellules souches embryonnaires (CSE), via un traitement avec la trypsine ESC.
2. Resuspendre les cellules dans 5 ml de milieu de différenciation et de transférer à un T25 sans gélatine couché. Incuber à 37 ° C pendant 45 minutes. Récupérer le surnageant et recueillir les cellules par centrifugation.
   
   Note: les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) de l'ESC cultures attachent facilement à la T25 sans gélatine couché et ne sont donc appauvri de la culture au cours de cette étape de placage. Si vous n'êtes pas la culture de votre ESC sur FAE, vous pouvez sauter la plaque pré-.
   
   
3. Resuspendre MEF appauvri CES dans les médias différenciation au 333 333 cells/50 ml. Cette concentration se traduit par 100 ml ESC/15.
4. L'utilisation multi-canal pipette, plaque ESC à 100 ml cells/15 déposer le 15 plaques de Pétri cm ^2. Avec une pipette à 8 canaux, vous devriez être en mesure d'adapter environ 18-22 rangées de gouttes par plaque (environ 5 ml par plaque).
   
   Remarque: Pour ce protocole, 2-5 15 cm ² plats de gouttes sera plus que suffisante et devrait donner 2-5 x 10 ⁶ six jours EB cellules dérivées.
   
   
5. Doucement retourner les plaques d'inverser gouttes. Incuber à 37 ° C CO ₂ 5% pendant 48 heures.
6. Piscine gouttes en remuant doucement les plaques et le transfert de 15 ml tube conique. Rincer les plaques avec 4-6 ml de PBS et ajouter à la même conique 15 ml.
   
   Note: Vous pouvez piscine jusqu'à cinq plaques goutte suspendue. L'EBS va croître car ils continuent de faire la différence et si elles sont trop concentrés, ils ont tendance à former de grosses touffes.
   
   
7. Autoriser commun EBS pour régler par la gravité (environ 10 minutes). Aspirer le surnageant sans déranger EBS. Doucement remettre en suspension dans 10 ml de différenciation des médias et de transfert à 10 cm de non-adhérentes boîte de Pétri.
8. Placer la plaque sur une plaque de Pétri agitateur à 50 tpm et incuber à 37 ° C à 5% de CO _2.
9. 24 heures plus tard (quatre jours de différenciation), les plaques de turbulence se concentrer EBS dans le centre du plat de Pétri. Soigneusement d'échange de 50% des médias (5 ml) avec 5 ml médias Différenciation frais. Retour plateau de l'incubateur pour deux jours de plus.

EB dissociation et l'infection par MSCV-HOXB4-IRES-GFP

1. Sur six jours de différenciation, le transfert EBS pour tube de 15 ml conique. Laisser décanter par gravité.
2. Aspirer les médias et les remettre en suspension dans 10 ml de PBS. Autoriser EBS pour réinstaller par la gravité. Aspirer le PBS.
3. Ajouter 250 ml Mélanger l'enzyme de dissociation et de 1 ml de PBS. Incuber à 37 ° C l'eau de bain pendant 20 minutes, parfois tourbillonnante du tube pour mélanger des enzymes et EBS.
4. Ajouter 8 ml sans enzyme tampon de dissociation.
5. Triturer le mélange avec 5 ml pipette jusqu'au EBS sont totalement dissociés (environ 10 fois; pipetage excessive augmentera la mort au sein de l'EB-dérivée préparation cellulaire).
   1. Mélange deviendra nuageux avec cellules comme EB dissocier.
   2. Placer la pointe de pipette contre le fond du tube conique lors de la trituration va créer une force de cisaillement qui facilitera grandement la dissociation.
6. Recueillir les cellules par centrifugation.
7. Resuspendre EB cellules dérivées dans 5 ml de IMDM 10% et comptent utiliser exclusion du bleu trypan
   
   Note: Entre quatre jours et six jours de différenciation, EBS cavitation qui se traduit par une grande quantité de l'apoptose et death.Thus cellule, à six jours, plus de 30% des EB cellules dérivées peuvent tache avec du bleu trypan.
   
   
8. Resuspendre les cellules dérivées de EB à 100.000 cellules / 2 ml de 10% IMDM + virale surnageant tel que une MOI de 5-10 est achieved.Add sulfate de protamine à une concentration finale de 8 mg / mL.
   
   Note: Préparer assez de EB / viraux mélange de surnageant à l'assiette quatre plaques à 6 puits (en supposant que 2 ml / puits).
   
   
9. Planche 2 ml EB / virale mélange surnageant par puits de quatre plaque de 6 puits de pré-plaqué avec des cellules du stroma OP9 (voir ci-dessous).
10. Centrifuger les plaques à 2500 rpm à température ambiante pendant 90 minutes. Transfert des plaques d'incubateur à 37 ° C 5% de CO _2.
11. 4-6 heures plus tard, la récolte surnageant de plaques et de collecter toutes les cellules potentielles restant en suspension par centrifugation.
12. Resuspendre le culot (peut être de petite taille) dans 48 ml IMDM 10% + cytokines. Distribuer 2 ml / puits de remise en suspension à l'initial de quatre plaques de 6 puits dans lequel l'infection a été effectuée et le surnageant a été recueilli.
    
    Remarque: Toujours préparer 10% IMDM + cytokines frais au moment de leur utilisation.
    
    
13. Incuber les plaques à 37 ° C CO ₂ 5% pour les sept jours. Colonies devrait être évident après l'infection de quatre jours et grandes et bien formé par sept jours. Une forte expansion devrait donner 40 à 60 colonies / puits sur sept jours.
14. Sur sept jours post-infection, de collecter et regrouper toutes les cellules (y compris OP9 stroma) de tous les puits par un traitement à la trypsine.
    
    Remarque: Ne pas jeter le surnageant ou PBS lave employées durant la trypsine treatment.At ce point dans la culture, certaines colonies peuvent être que faiblement adhérentes et il ya de nombreuses cellules floaTing dans suspension.Collect et la piscine tous les lavages et un surnageant afin de s'assurer qu'aucun des cellules potentiellement précieuses sont jetés.
    
    
15. Resuspendre les cellules dans 8 ml IMDM 10% + frais de cytokines. Distribuer 2 ml / flacon en quatre flacons T75. Ajouter une supplémentaire de 13 ml + 10% cytokines IMDM à chaque flacon. Incuber à 37 ° C 5% CO ₂ pendant trois jours (soit un total de dix jours après l'infection).

Culture et le placage de OP9 stroma

1. Maintenir OP9 stroma selon des protocoles standard de 20% a-MEM. OP9 cellules va changer les propriétés lorsqu'il est cultivé jusqu'à la confluence. Toujours diviser à 80% de confluence à pas plus de 1h03 divisée.
2. 24 heures avant l'infection des six jours EB cellules dérivées d'MSCV-HOXB4-IRES-GFP, plaque 25000 OP9 cellules / puits de quatre plaques de 6 puits dans 20% une MEM-.

Collection, le fractionnement et la transplantation

1. Recueillir les cellules du stroma OP9 élargi sur une dizaine de jours par traitement à la trypsine. Compter les cellules.
   
   Remarque: Ne pas jeter le surnageant ou PBS lave employée pendant le traitement trypsine. À ce stade de la culture, certaines colonies peuvent être que faiblement adhérentes et il ya beaucoup de cellules flottant dans suspension.Collect et la piscine tous les lavages et un surnageant afin de s'assurer qu'aucun des cellules potentiellement précieuses sont jetés.
   
   Note: Une bonne expansion devrait donner entre 40-50 x 10 ⁶ cellules / 6 original bien-plaque infectés, pour un total de 160-200 x 10 ⁶ cellules.
   
   
2. Les cellules peuvent être fractionnés par sélection billes magnétiques ou FACS selon des techniques standard à ce point dans le protocole.
3. Pour la transplantation, de livrer les cellules via rétro-orbitaires ou injection veine de la queue d'Rag-2/gc destinataires déficiente (pesant entre 15-22 grammes) soumis à une dose de 9,25 Gy diviser d'irradiation 2,5 heures. de l'autre.
   
   Note: Il est essentiel que le poids des animaux tombent entre 15-22 grammes au moment de l'irradiation. Si elles sont plus grandes que 22 grammes, 9,25 Gy ne sera pas une dose suffisante de l'irradiation pour assurer l'ablation appropriées et les cellules ne peuvent pas servir de médiateur de sauvetage de l'irradiation létale et / ou se greffer le compartiment hématopoïétique. Si la transplantation de plus grands animaux, la dose d'irradiation approprié doit être déterminée expérimentalement.
   
   
4. Une dose minimale de 2-5 x 10 ⁶ cellules / animal est nécessaire pour garantir le sauvetage de l'irradiation mortelle. Si le fractionnement des cellules, injecter 2-5 x 10 ⁶ cellules équivalents (par exemple si la population d'intérêt représente 10% du pool de cellules non fractionnée, injecter 2-5 x 10 ⁵ cellules / animal).
   
   Remarque: Si l'injection de> 2 x 10 ⁶ cellules, TOUJOURS injectent via veine de la queue pour éviter la formation de tératome en orbite, ce qui peut se produire lorsque le nombre élevé de cellules sont livrés rétro-orbital.
   
   
5. Maintenir Rag-2 ^{- / -} / gc ^{- / -} déficiente destinataires dans des cages en autoclave. Selon le «propreté» de l'animalerie, post-transplantation d'animaux peut nécessiter l'administration de l'eau acidifiée ou Trimethiprim-Sulfasoxazole (Septra) pour les 5 semaines suivant le rayonnement mortel.
   
6. Attendez-vous> GFP + 90% ES dérivées de leucocytes dans le sang périphérique à 3 semaines post-transplantation. La prise de greffe doit être multi-lignée, même si les lymphocytes sont connus pour réduire au silence rétroviraux HOXB4-IRES-GFP.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57Bl/6 Rag-2/gamma-c deficient mice	Animal	Taconic Farm
Plate shaker	Tool	VWR international	33998-360	Orbital Shaker by Ikaworks
Multi-channel pipettor	Tool	VWR international	15000-174	ePet by BioHit
ES trypsin	Reagent	Invitrogen	15090-046	0.25% Trypsin in PBS
Standard trypsin	Reagent	Invitrogen	25300-062	0.05% Trypsin-EDTA
PBS	Buffer	Invitrogen	20012-027
Enzyme-free dissociation buffer	Buffer	Invitrogen	13151-014
Dissociation enzyme mix	Buffer	Invitrogen	17104-019	500 mg Collagenase IV
Hyaluronidase	Reagent	Sigma-Aldrich	H2126	freeze in 500 μL aliquots and avoid repeated freezing and thawing.
DNAse	Reagent	Sigma-Aldrich	D4527
DMEM		Invitrogen	10-017CV
Protamine sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	P3369	8 μg/mL
EB differentiation media	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
10% IMDM+cytokines	medium			Please view recipe on attached Protocol.doc
20% anti-MEM				Please view recipe on attached Protocol.doc