מלכודות תאי נויטרופילים: כיצד ליצור מדמיינים אותם

Summary

מלכודות תאי נויטרופילים (NETS) הן מנגנון חשוב החיסון המולדת להילחם חיידקים פתוגניים, פטריות וטפילים. כאן אנו מתארים שיטות לבודד גרנולוציטים נויטרופילים מהדם האנושי כדי להפעיל אותם בצורה הרשתות. אנו מציגים טכניקות הכנה לדמיין הרשתות מיקרוסקופ אור אלקטרונים.

Abstract

גרנולוציטים נויטרופילים הם הקבוצה הנפוץ ביותר של לויקוציטים בדם ההיקפי. כפי phagocytes מקצועי, הם חיידקים לבלוע ולהרוג אותם intracellularly כאשר גרגרי הפתיל מיקרוביאלית שלהם עם phagosome. מצאנו כי נויטרופילים יש דרך נוספת של הרג מיקרואורגניזמים: על הפעלה, הם משחררים חלבונים גרגיר וכרומטין כי יחד טופס סיבי תאית כי פתוגנים לאגד. אלו מבנים חדשים, או מלכודות תאי נויטרופילים (סלים), לבזות גורמים ארסיות ו ¹ להרוג חיידקים, פטריות וטפילים ^{2 3.} עמוד השדרה הוא מבנה של רשתות ה-DNA, והם מפורקים במהירות בנוכחות DNases. לפיכך, חיידקים להביע DNases הם אלימים יותר ^4. באמצעות מיקרוסקופ המצטרף שילוב TEM, SEM, immunofluorescence ולחיות טכניקות הדמיה התא, נוכל להראות כי על גירוי, הגרעינים של נויטרופילים מאבדים את צורתם ואת האיחוד האירופי ו heterochromatin homogenize. מאוחר יותר, את המעטפה גרעיני ממברנות גרגיר להתפורר ומאפשר ערבוב של הרכיבים NET. לבסוף, הנטס משתחררים כמו הפסקות קרום התא. זה מוות של תאים התוכנית (NETosis) הוא נבדל אפופטוזיס ונמק ותלוי הדור של מינים החמצן מגיב על ידי מונואמין NADPH ^5.

מלכודות תאי נויטרופילים נפוצים באתרים של דלקת חריפה. NETS להיראות סוג של תגובה חיסונית מולדת כי מיקרואורגניזמים לאגד, למנוע מהם להתפשט, ולהבטיח ריכוז מקומי גבוה של סוכני מיקרוביאלית לבזות גורמים ארסיות ולהרוג פתוגנים ובכך מאפשר נויטרופילים למלא פונקציה מיקרוביאלית שלהם גם מעבר תוחלת החיים שלהם. יש להגדיל את הראיות, עם זאת, רשתות, כי הם מעורבים גם מחלות אשר נע בין אוטואימוניות תסמונות לעקרות ^6.

אנו מתארים שיטות לבודד גרנולוציטים נויטרופילים מתוך ⁷ דם היקפיים האדם לעורר אותם בצורה הרשתות. כמו כן, אנו כוללים פרוטוקולים לדמיין את הרשתות מיקרוסקופ אור אלקטרונים.

Protocol

1. PMN ניתוק מן דם אדם

השתמש על דם אנושי 24 מ"ל עם EDTA או הפרין (10 U / ml) כמו נוגד קרישה.

1. הוסף 6 מ"ל Histopaque 1119 על צינור פלקון 15 מ"ל ובזהירות 5-7 שכבת מ"ל דם מלא על העליונה.
2. צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 800 XG ללא בלימה.
3. לשאוב ולזרוק השכבה העליונה צהבהב ברור ולהעביר שלב נמוך יותר אדמדם המכיל גרנולוציטים טרי לתוך צינורות פלקון.
4. שטפו תאים על ידי ממלא את הצינורות פלקון עם PBS ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 300 x ז
5. בינתיים להכין פתרון Percoll 100% על ידי ערבוב 18 מ"ל Percoll עם 2 מ"ל PBS 10x. עם 1x PBS להכין 4 פתרונות מ"ל של 85%, 80%, 75%, 70% ו 65% Percoll.
6. הכן 2 מבחנות פלקון עם שיפוע Percoll ידי מ"ל 2 שכבות של אחוז כל אחד על השני בסדר יורד.
7. לאחר צנטריפוגה להסיר את supernatant, לשלב כדורי ותאי משקעים resuspend ב 4 מ"ל של PBS.
8. בזהירות שכבה 2 מ"ל של resuspension על כל אחד gradients.
9. צנטריפוגה במשך 20 דקות ב 800 XG ללא בלימה.
10. לאחר צנטריפוגה להסיר את השכבה העליונה ביותר של שכבה% 65 עם PBMCs ולאסוף interphases הנותרים לבן עד שכבה 85% לתוך צינורות חדשים פלקון.
11. שטפו תאים על ידי מילוי את צינורות פלקון עם PBS ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 300 x ז
12. הסרת תאים משקעים supernatant ו resuspend (בדרך כלל> 95% הם PMN) ב 2ml של PBS.
13. ספירת תאים באמצעות hemocytometer.

2. הפעלת PMNs

1. הכן 24 גם תרבות צלחת התא על ידי הצבת סטרילית 13 מ"מ זכוכית עגול לכסות להחליק (# 1,5) לתוך כל טוב
2. Seed 2 x 10 ⁵ תאים 500μl RPMI (המכיל 2% אנושי בסרום אלבומין) לכל היטב דגירה עבור 1h ב-CO ₂ באינקובטור ב 37 ° C.
3. בינתיים להכין 600 nM PMA פתרון RPMI ולהוסיף תאים 100μl לכל טוב. דגירה של 15 דקות עד 4 שעות ב-CO ₂ באינקובטור ב 37 ° C.
4. תקן תאים 4% (ריכוז בסוף) paraformaldehyde מומס PBS.

PMA משמש בקרה חיובית היא עד עכשיו הסוכן החזק ביותר כדי לגרום להיווצרות NET. לחלופין, גירויים אחרים או שיתוף טיפוח עם פתוגנים יכול לשמש לזירוז NET.

מעמדו של היווצרות בהתאמה NET ניתן לבדוק כמובן בעוד זמן מתנהל, אם דגימות במקביל נוספים מוכנים. אם צבע לא permeant DNA כמו Sytox הירוק (Invitrogen) מתווסף הלא קבוע תאים, רק תאי ה-DNA יזוהו. מאז הקמת רשתות חדשות נפגעת איכשהו בנוכחות Sytox, לכל נקודת זמן דגימה אחת במקביל יש להשתמש.

3. זיהוי על ידי NET immunolabeling

NETS הם שבירים מאוד, גם לאחר קיבוע ויהיה צורך לטפל בזהירות רבה, אחרת רוב תלך לאיבוד במהלך תקופת ההכנה.

1. בזהירות להסיר מכסה מחליק זכוכית עם תאים המצורפת מהצלחת 24 גם על ידי תרבות מרימה אותו בקצה עם מחט מעוקל לתפוס אותו עם מלקחיים בסדר. שים את הפתק לכסות במהופך על ירידה של PBS. ניתן לעשות זאת על גיליון Parafilm המכסים לעמוד מבחנה. לשטוף ככה 3 פעמים 5 דקות.
2. דגירה תלושי לכסות באותו אופן לירידה של 0.5% Triton X-100 דקות ב 1 RT כדי permeabilize תאים. לשטוף 3 פעמים PBS דקות 1.
3. הכינו תא לח עם Parafilm וכן רקמות רטוב. Lay לכסות את תלושי במהופך על ירידה של חיץ חסימה (5% חמור בדם) ו דגירה למשך 30 דקות ב 37 ° C.
4. מדולל נוגדנים ראשוניים, למשל ms אנטי Histon ו rb נגד נויטרופילים Elastase, בחסימת חיץ.
5. העברת מכסה מחליק בתא לח ישירות חסימת חיץ על ירידה של הנוגדן הראשוני דגירה של 1 ש 'ב 37 ° C.
6. לשטוף 3 פעמים 5 דקות עם PBS.
7. מדולל נוגדנים משנית, למשל dk אנטי ms Cy2 ו dk אנטי rb Cy3, בחסימת חיץ.
8. העברת מכסה מחליק לתוך תא לח על ירידה של נוגדנים משני דגירה של 1 ש 'ב 37 ° C.
9. לשטוף 3 פעמים 5 דקות עם PBS. בהתאם לאפשרויות שלך מיקרוסקופ פלואורסצנטי, DNA כתם במשך 5 דקות או עם Hoechst 33,342 (1 מיקרוגרם / מ"ל) אשר יצטרכו עירור UV או עם Draq5 עבור עירור אדום רחוק ולשטוף פעמיים עם dist. המים.
10. הגדר ירידה של 20μl Mowiol לשקופית זכוכית הר תלושי לכסות עם תאים במהופך. התאים צריכים להיות בין להחליק את המכסה המחליק. ירידה של Mowiol יהוו שכבה דקה של עובי אחיד כאשר להחליק לכסות ממוקם על הירידה. בדרך כלל, אין צורך ללחוץ על מדגם. אם אתה רוצה להשתמש בעדשות-טבילה לא, הדגימה מוכן לבדיקה.ניתוח מיקרוסקופי עם עדשות טבילה, שלא הדגימה יבש במשך שעה על 1 עד Mowiol יש הקרושה בקצה של המדגם.

4. NETS הכנה מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM)

1. הודעה על התאים לתקן את מכסה מחליק כוס בצלחת 24-היטב עם glutaraldehyde 2,5%.
2. הסרת מכסה זכוכית תלושי המכיל תאים מהצלחת 24 גם תרבות לשים במהופך על טיפת מים. לשטוף ככה 3 פעמים 5 דקות.
3. העברת הכיסוי האחורי מחליק לתוך צלחת 24 גם תא תרבות המכיל 0.5% OsO4 ו דגירה למשך 30 דקות.
4. הסרת מכסה זכוכית תלושי המכיל תאים מהצלחת 24 גם תרבות לשים במהופך על טיפת מים. לשטוף ככה 3 פעמים 5 דקות.
5. העברת הכיסוי האחורי מחליק לתוך צלחת 24 גם תא תרבות המכילים חומצה טאני 1% ו דגירה למשך 30 דקות.
6. חזור על שלבים 4.2-4.4
7. מייבשים באמצעות משטר הבאה (5min כל אחת):
   • 30% אתנול
   • 50% אתנול
   • 70% אתנול
   • 80% אתנול
   • 90% אתנול
   • 100% אתנול
   • 100% אתנול
   • 100% אתנול
8. העברת מכסה מחליק לתוך מייבש נקודה קריטית דגימות יבש.
9. מעיל פני השטח של הדגימה בשכבה פלטין / פחמן 5nm באמצעות המאייד שכבה דקה

5. נציג תוצאות:

שיטת בידוד בדרך כלל תשואות נויטרופילים קיימא unstimulated עם טוהר יותר מאשר 95%. כאשר קבוע בנקודות זמן שונות לאחר הגירוי, פרוטוקול immunostaining מציגה את רצף של שינויים מורפולוגיים במהלך תא NETosis משטחת, אובדן האוניות גרעיני, אובדן גרגיר שלמות הגרעין שמוביל חפיפה הגוברת של הגרעין (כלומר היסטון) ו פרטנית (כלומר נויטרופילים Elastase) מכתים. פרוטוקול זה יכול לשמש כנקודת מוצא לניתוח אינטראקציות ספציפיות של פתוגנים עם נויטרופילים. אינטראקציה זו יכולה להיות ניתח בפירוט רב יותר באמצעות פרוטוקול כהכנה מיקרוסקופיית אלקטרונים.

NET פלואורסצנטי

דוגמה של נויטרופילים מגורה מוכתם עבור רכיבים NET (כחול = DNA, אדום = היסטון, ירוק = נויטרופילים Elastase). התמונות מראות, מלבד לוקליזציה NET, לוקליזציה של DNA גרעיני ההיסטונים ואת תבנית פרטנית עבור נויטרופילים Elastase.

SEM גירוי PMA

סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים מראה נויטרופילים מגורה PMA-מגורה לא. לאחר גירוי, נויטרופילים לשטח החוצה לייצר הרשתות.

SEM רשתות Shigella

רזולוציה גבוהה SEM התמונה של החיידק שיגלה לכודים הרשתות.

Discussion

פרוטוקול בתנאי יאפשר את בידודה של נויטרופילים מגורה על טוהר הלא מבוטל, הגיוס של היווצרות NET ועל ניתוח של שינויים מורפולוגיים במהלך NETosis. כאשר הטיפול דגימות בזהירות, כלומר הימנעות כביסה התנאים הקשים אשר תגרום לאובדן של רוב NETS מחוברת באופן רופף, בסכום של היווצרות NET בתנאים גירויים שונים (משך, גירוי) ניתן להשוות. במובן זה, את הפרוטוקולים ובלבד יכול לשמש כנקודת מוצא להקים שיטות לנתח תרחישים מתוחכמים יותר: אינטראקציות נויטרופילים / הפתוגן, רצף של גירויים, יחסי הגומלין עם תאים חיסוניים אחרים.