Neutrófilos Traps Extracelular: Como Gerar e visualizá-los

Resumo

Neutrófilos Traps Extracelular (NET) são um mecanismo inato importante imunológico para combater as bactérias patogênicas, fungos e parasitas. Aqui nós descrevemos métodos para isolar granulócitos neutrófilos do sangue humano e para ativá-las para formar redes. Nós apresentamos técnicas de preparação para visualizar NETs em microscopia óptica e eletrônica.

Resumo

Granulócitos neutrófilos são o grupo mais abundante de leucócitos no sangue periférico. Como fagócitos profissionais, eles bactérias engolir e matá-los intracelularmente quando seu fusível grânulos antimicrobiana com o fagossomo. Descobrimos que os neutrófilos têm uma maneira adicional de matar microorganismos: após a ativação, liberam proteínas granulares e cromatina que juntos formam as fibras extracelulares que se ligam patógenos. Estas novas estruturas, ou neutrófilos Traps Extracelular (NET), degradam fatores de virulência e matar as bactérias ^1, fungos e parasitas ^{2 3.} A espinha dorsal estrutural da NET é o DNA, e eles são rapidamente degradados na presença de DNases. Assim, as bactérias expressando DNases são mais virulentas ^4. Usando a microscopia correlativos combinando TEM, SEM, técnicas de imagem de imunofluorescência e de células vivas, poderíamos mostrar que com a estimulação, os núcleos de neutrófilos perdem sua forma e eu e heterocromatina homogeneizar. Mais tarde, o envelope nuclear e as membranas grânulos desintegrar permitindo a mistura de componentes NET. Finalmente, as redes são lançadas como as quebras de membrana celular. Este programa de morte celular (NETosis) é distinta da apoptose e necrose e depende da geração de espécies reativas de oxigênio pela NADPH oxidase ^5.

Neutrófilos armadilhas extracelular são abundantes nos locais de inflamação aguda. NET parecem ser uma forma de resposta imune inata que os microorganismos se ligam, evitar a sua disseminação, e garantir uma alta concentração local de agentes antimicrobianos para degradar fatores de virulência e matar agentes patogênicos, permitindo assim neutrófilos para cumprir sua função antimicrobiana, mesmo para além do seu tempo de vida. Há crescentes evidências, no entanto, que as redes também estão envolvidos em doenças que vão desde auto-imune síndromes à infertilidade ^6.

Descrevemos métodos para isolar Granulócitos neutrófilos de sangue periférico humano ⁷ e estimulá-los a formar redes. Também incluímos protocolos para visualizar a NET em microscopia óptica e eletrônica.

Protocolo

1. PMN de isolamento do sangue humano

Use cerca de 24 ml de sangue humano com EDTA ou heparina (10 U / ml) como anticoagulante.

1. Adicionar 6 ml Histopaque 1119 a um tubo de Falcon 15 ml e cuidadosamente camada ml de sangue 5-7 todo em cima.
2. Centrifugar por 20 minutos a 800 xg sem travões.
3. Aspirar e descartar amarelada e clara camada superior e inferior de transferência de fase avermelhada contendo granulócitos em tubos Falcon fresco.
4. Lave as células através do preenchimento de tubos Falcon com PBS e centrifugar por 10 minutos a 300 x g.
5. Nesse meio tempo preparar uma solução Percoll 100% através da mistura de 18 ml Percoll com 2 ml de PBS 10x. Com PBS 1x preparar quatro soluções ml de 85%, 80%, 75%, 70% e Percoll 65%.
6. Prepare 2 tubos Falcon com um gradiente de Percoll por camadas de 2 ml de cada porcentagem em cima uns dos outros em ordem decrescente.
7. Após a centrifugação remover o sobrenadante, combine pelotas e ressuspender as células sedimentadas em 4 ml de PBS.
8. Cuidadosamente camada 2 ml da ressuspensão em cada um dos gradientes.
9. Centrifugar por 20 minutos a 800 xg sem travões.
10. Após a centrifugação remover camada superior ea maioria dos 65% da camada de PBMCs e recolher com interfase branco restante até 85% da camada em tubos Falcon nova.
11. Lave as células por encher os tubos Falcon com PBS e centrifugar por 10 minutos a 300 x g.
12. Remover o sobrenadante e ressuspender as células sedimentadas (geralmente> 95% são PMN) em 2 ml de PBS.
13. Contagem de células utilizando um hemocitômetro.

2. PMNs ativando

1. Prepare uma placa de 24 poços de cultura de células, colocando uma estéril 13 milímetros rodada lamínula de vidro (# 1,5) em cada poço
2. Semente de 2 x 10 ⁵ células em 500μl RPMI (contendo 2% de soro humano de albumina) por poço e incubar por 1h em incubadora de CO ₂ a 37 ° C.
3. Enquanto isso, prepare a 600 nM solução PMA em RPMI e adicionar 100μl de células por poço. Incubar de 15 min até 4 h em incubadora de CO ₂ a 37 ° C.
4. Fix células em 4% (concentração final) paraformaldeído dissolvido em PBS.

PMA serve como um controle positivo e é até agora o agente mais potente para induzir a formação de NET. Alternativamente, outros estímulos ou co-cultivo com patógenos podem ser utilizados para a indução NET.

Do respectivo estatuto de formação NET pode ser verificado quando o curso do tempo é de continuar, se forem complementares amostras paralelas estão preparados. Se um corante de DNA não-permeante como Sytox Green (Invitrogen) é adicionada às células não-fixa, apenas DNA extracelular será detectado. Desde a formação de novas redes é de alguma forma prejudicada na presença de Sytox, para cada ponto do tempo uma amostra paralela tem que ser usado.

3. NET detecção por imunomarcação

NET são muito frágeis, mesmo após a fixação e tem que ser manipulado com muito cuidado, caso contrário, a maioria vai ficar perdido durante a preparação.

1. Remova cuidadosamente lamínulas de vidro com células anexado a partir de 24 poços placa de cultura, levantando-a na borda com uma agulha curva e aproveitá-la com uma pinça fina. Coloque a lamínula de cabeça para baixo em uma gota de PBS. Isto pode ser feito em uma folha Parafilm cobrindo uma posição tubo de ensaio. Lavar 3 vezes como esta por 5 min.
2. Incubar lamínulas da mesma maneira em uma queda de 0,5% Triton X-100 por 1 min em temperatura ambiente para permeabilizar as células. Lavar 3 vezes em PBS por 1 min.
3. Prepare uma câmara úmida com Parafilm e um tecido molhado. Lay a tampa desliza de cabeça para baixo em uma gota de tampão de bloqueio (5% burro soro) e incubar por 30 min a 37 ° C.
4. Diluir anticorpos primários, por exemplo, ms anti Histon rb e anti elastase neutrofílica, em tampão de bloqueio.
5. Transferência de capa desliza na câmara úmida diretamente do tampão de bloqueio em uma gota de anticorpo primário e incubar por 1 hora a 37 ° C.
6. Lavar 3 vezes por 5 minutos com PBS.
7. Diluir anticorpos secundários, por exemplo dk anti ms Cy2 e dk anti rb Cy3, em tampão de bloqueio.
8. Transferência de capa desliza para dentro da câmara úmida em uma gota de anticorpo secundário e incubar por 1 hora a 37 ° C.
9. Lavar 3 vezes por 5 minutos com PBS. Dependendo das suas opções de microscopia de fluorescência, o DNA da mancha por 5 min ou com Hoechst 33342 (1 mg / ml), que vai precisar de excitação UV ou com DRAQ5 para excitação muito vermelho e lavar duas vezes com dist. água.
10. Definir uma gota de 20μl Mowiol numa lâmina de vidro e montar lamínulas com as células de cabeça para baixo. As células têm que ser entre a lamínula ea lâmina. A queda de Mowiol formará uma fina camada de espessura homogênea quando a lamínula é posicionado sobre a queda. Normalmente, não há necessidade de pressionar a amostra. Se você quiser usar lentes não-imersão, a amostra está pronta para a inspeção.Para análise microscópica com lentes de imersão, deixe a amostra secar por cerca de uma hora até que o Mowiol solidificou na borda da amostra.

4. NET preparando para Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

1. Pós corrigir células na tampa de vidro desliza em 24 poços da placa com glutaraldeído 2,5%.
2. Remova folhas tampa de vidro contendo células de 24 poços placa de cultura e colocar de cabeça para baixo em uma gota de água. Lavar 3 vezes como esta por 5 min.
3. Transferência de lamínulas de volta para 24 poços da placa de cultura de células contendo 0,5% OsO4 e incubar por 30 min.
4. Remova folhas tampa de vidro contendo células de 24 poços placa de cultura e colocar de cabeça para baixo em uma gota de água. Lavar 3 vezes como esta por 5 min.
5. Transferência de lamínulas de volta para 24 poços da placa de cultura de células contendo 1% de ácido tânico e incubar por 30 min.
6. Repita os passos de 4,2-4,4
7. Desidratar através do seguinte esquema (5min cada):
   • Etanol 30%
   • Etanol a 50%
   • Etanol 70%
   • Etanol 80%
   • Etanol 90%
   • Etanol 100%
   • Etanol 100%
   • Etanol 100%
8. Transferência de capa desliza em secador de ponto crítico e amostras secas.
9. Superfície da camada de amostra com camada de platina / carbono 5nm usando evaporador camada fina

5. Resultados representativos:

O método de isolamento geralmente produz unstimulated neutrófilos viável com uma pureza superior a 95%. Quando fixado em diferentes momentos após a estimulação, o protocolo imunocoloração mostra a seqüência de alterações morfológicas durante o celular NETosis achatamento, perda de lóbulos nuclear, perda de grânulos e integridade núcleo que conduz a uma crescente sobreposição de armas nucleares (ou seja, histona) e granular (ie A elastase neutrofílica coloração). Este protocolo pode servir como ponto de partida para analisar as interações específicas de patógenos com neutrófilos. Essa interação pode ser dissecada em maior detalhe utilizando o protocolo de preparação para microscopia eletrônica de varredura.

Fluorescência NET

Amostra de neutrófilos estimulados manchada para componentes de NET (azul = DNA, histona vermelho = verde = elastase neutrofílica). As imagens mostram, além da localização NET, a localização nuclear do DNA e as histonas eo padrão granular para a elastase neutrofílica.

SEM estimulação PMA

Micrografia eletrônica de varredura mostrando neutrófilos não estimulados e PMA-estimulado. Após a estimulação, os neutrófilos achatar e produzir NETs.

SEM NET e Shigella

Maior resolução de imagem SEM de bactérias Shigella presos em redes.

Discussão

O protocolo permitirá que desde o isolamento de neutrófilos não estimulados a pureza considerável, a indução da formação de NET e da análise das alterações morfológicas durante NETosis. Ao manusear as amostras com cuidado, ou seja, evitando duras condições de lavagem, que resultará na perda da maioria dos NETs frouxamente ligados, a quantidade de formação NET em condições diferentes de estimulação (duração, de estímulo) podem ser comparados. A este respeito, os protocolos fornecidos podem servir como ponto de partida para estabelecer métodos para analisar cenários mais sofisticados: interações de neutrófilos / patógeno, a seqüência de estímulos, interação com outras células do sistema imunológico.