Neutrofili Trappole extracellulare: Come generare e poterle visualizzare

Riepilogo

Neutrofili Trappole extracellulare (NET) sono un importante meccanismo immunitario innato per combattere i batteri patogeni, funghi e parassiti. Qui si descrivono i metodi per isolare i granulociti neutrofili dal sangue umano e di attivare per formare NET. Vi presentiamo le tecniche di preparazione di visualizzare reti in microscopia ottica ed elettronica.

Abstract

Granulociti neutrofili sono il gruppo più abbondante di leucociti nel sangue periferico. Come fagociti professionali, fagocitare i batteri e li uccidono intracellulare quando la loro miccia antimicrobica granuli con la phagosome. Abbiamo scoperto che i neutrofili sono un ulteriore modo di uccidere i microorganismi: al momento dell'attivazione, rilasciano le proteine ​​dei granuli e cromatina che insieme formano le fibre extracellulari che legano gli agenti patogeni. Queste nuove strutture, o neutrofili Trappole extracellulare (NET), degradano fattori di virulenza e di uccidere i batteri ^{1, 2} e funghi parassiti ^3. La spina dorsale strutturale del NET è il DNA, e sono rapidamente degradati in presenza di DNasi. Così, i batteri che esprimono DNasi sono più virulenti ^4. Utilizzando la microscopia correlativa combinando TEM, SEM, immunofluorescenza e vivere tecniche di imaging cellulare, abbiamo potuto dimostrare che dopo la stimolazione, i nuclei di neutrofili perdono la loro forma e la eu-eterocromatina e omogeneizzare. Più tardi, l'involucro nucleare e le membrane dei granuli disintegrano permettendo la miscelazione dei componenti NET. Infine, le reti sono rilasciati come rompe la membrana cellulare. Questo programma di morte cellulare (NETosis) è distinto da apoptosi e necrosi e dipende dalla generazione di specie reattive dell'ossigeno da NADPH ossidasi ^5.

Neutrofili trappole extracellulare sono abbondanti nei siti di infiammazione acuta. NET sembrano essere una forma di risposta immunitaria innata che i microrganismi si legano, impediscono loro di diffondere e garantire una elevata concentrazione locale di agenti antimicrobici per degradare fattori di virulenza e uccidere gli agenti patogeni permettendo neutrofili per assolvere la loro funzione antimicrobica anche oltre la durata della loro vita. C'è una crescente evidenza, tuttavia, che le reti sono anche coinvolti in malattie che vanno da auto-immune sindromi alla sterilità ^6.

Si descrivono i metodi per isolare i granulociti neutrofili dal sangue umano periferico ⁷ e stimolarli a formare NET. Inoltre abbiamo incluso i protocolli per visualizzare le reti in microscopia ottica ed elettronica.

Protocollo

1. Isolamento PMN dal sangue umano

Utilizzare circa 24 ml di sangue umano con EDTA o eparina (10 U / ml) come anticoagulante.

1. Aggiungere 6 ml HISTOPAQUE 1119 in una provetta da 15 ml Falcon e con attenzione strato di 5-7 ml di sangue intero in cima.
2. Centrifugare per 20 minuti a 800 xg senza frenare.
3. Aspirare e scartare giallastro e chiaro strato superiore e di trasferimento inferiore fase rossiccio contenenti granulociti in fresco tubi Falcon.
4. Lavare le cellule compilando i tubi Falcon con PBS e centrifugare per 10 minuti a 300 x g.
5. Nel frattempo preparare una soluzione Percoll al 100%, mescolando 18 ml Percoll con 2 ml di PBS 10x. Con 1x PBS preparare 4 soluzioni ml di 85%, 80%, 75%, 70% e 65% Percoll.
6. Preparare 2 tubi Falcon con un gradiente di Percoll stratificando 2 ml di ogni percentuale sopra l'altro in ordine decrescente.
7. Dopo la centrifugazione eliminare il surnatante, combinare pellet e risospendere le cellule sedimentate in 4 ml di PBS.
8. Con attenzione il livello 2 ml di risospensione su ognuno dei gradienti.
9. Centrifugare per 20 minuti a 800 xg senza frenare.
10. Dopo la centrifugazione rimuovere strato superiore e la maggior parte del 65%-strato con PBMC e raccogliere bianco interfasi rimanente fino a 85%-strato in nuovi tubi Falcon.
11. Lavare le cellule riempiendo i tubi Falcon con PBS e centrifugare per 10 minuti a 300 x g.
12. Rimuovere le cellule sedimentate surnatante e risospendere (di solito> 95% sono PMN) in 2 ml di PBS.
13. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.

2. Attivazione di PMN

1. Preparare un 24-pozzetti coltura cellulare mettendo una sterile 13 millimetri rotonda scivolare coperchio in vetro (# 1,5) in ciascun pozzetto
2. Semi di 2 x 10 ⁵ cellule in 500μl RPMI (contenente 2% albumina sierica umana) per bene e incubare per 1h di CO ₂ incubatore a 37 ° C.
3. Nel frattempo preparare una soluzione di 600 nM PMA in RPMI e aggiungere 100μl di cellule per pozzetto. Incubare da 15 minuti fino a 4 ore di CO ₂ incubatore a 37 ° C.
4. Fissare le cellule nel 4% (concentrazione finale) paraformaldeide sciolto in PBS.

PMA funge da controllo positivo e fino ad ora è l'agente più potente per indurre la formazione di NET. In alternativa, altri stimoli o co-coltivazione con agenti patogeni possono essere utilizzati per l'induzione NET.

Lo stato della formazione rispettivi NET possono essere controllate, mentre il periodo di tempo sta procedendo, se ulteriori campioni paralleli sono preparati. Se un non-permeanti colorante DNA come Sytox verde (Invitrogen) si aggiunge alla non fisse celle, solo il DNA extracellulare verrà rilevato. Poiché la formazione di nuove reti è in qualche modo compromessa in presenza di Sytox, per ogni punto volta un campione parallelo deve essere utilizzato.

3. Rilevamento NET immunomarcatura

NET sono molto fragili, anche dopo la fissazione e devono essere manipolati con grande cura, altrimenti la maggioranza si perde durante la preparazione.

1. Rimuovere con attenzione scivola copertura in vetro con celle collegate dal 24-pozzetti cultura sollevandola al margine con un ago curvo e afferrare con una pinza sottile. Mettere il coperchio scivolare a testa in giù su una goccia di PBS. Questo può essere fatto su un foglio Parafilm che copre uno stand provetta. Lavare così 3 volte per 5 min.
2. Incubare i vetrini coprioggetto nello stesso modo in un calo dello 0,5% Triton X-100 per 1 min a RT al permeabilize cellule. Lavare 3 volte in PBS per 1 min.
3. Preparare una camera umida con Parafilm e un panno bagnato. Posare il coperchio scivola a testa in giù su una goccia di tampone di bloccaggio (5% asino siero) e incubare per 30 minuti a 37 ° C.
4. Diluire gli anticorpi primari, ad esempio ms contro Histon e rb contro elastasi neutrofila, nel tampone di bloccaggio.
5. Trasferimento di copertura scivola nella camera umida direttamente dal tampone di bloccaggio su una goccia di anticorpo primario e incubare per 1 ora a 37 ° C.
6. Lavare 3 volte per 5 minuti con PBS.
7. Diluire anticorpi secondari, ad esempio dk contro ms Cy2 e dk contro rb Cy3, nel tampone di bloccaggio.
8. Trasferimento coprire scivola nella camera umida su una goccia di anticorpo secondario e incubare per 1 ora a 37 ° C.
9. Lavare 3 volte per 5 minuti con PBS. A seconda delle opzioni di microscopia a fluorescenza, il DNA macchia per 5 minuti sia con Hoechst 33342 (1 mg / ml) che necessitano di eccitazione UV o con Draq5 per l'eccitazione lontano rosso e lavare due volte con dist. acqua.
10. Impostare una goccia di 20μl Mowiol su un vetrino coprioggetto e montare con le cellule a testa in giù. Le cellule devono essere tra il vetrino e la diapositiva. La goccia di Mowiol formerà un sottile strato di spessore omogeneo in cui la polizza di copertura è posizionato sulla goccia. Normalmente, non c'è bisogno di premere il campione. Se si desidera utilizzare non immersione lenti, il campione è pronto per l'ispezione.Per l'analisi microscopica con lenti ad immersione, lasciare che il campione secco per circa 1 ora fino a quando il Mowiol è solidificato al bordo del campione.

4. NET preparazione per microscopia elettronica a scansione (SEM)

1. Messaggio fissare le cellule sul vetrino coprioggetto di vetro a 24-pozzetti con il 2,5% glutaraldeide.
2. Rimuovere i vetrini coprioggetto di vetro contenenti cellule dal 24-pozzetti cultura e messo a testa in giù su una goccia d'acqua. Lavare così 3 volte per 5 min.
3. Trasferimento scivola coperchio posteriore in 24 pozzetti di coltura cellulare contenente 0,5% OsO4 e incubare per 30 min.
4. Rimuovere i vetrini coprioggetto di vetro contenenti cellule dal 24-pozzetti cultura e messo a testa in giù su una goccia d'acqua. Lavare così 3 volte per 5 min.
5. Trasferimento scivola coperchio posteriore in 24 pozzetti di coltura cellulare contenente 1% di acido tannico e incubare per 30 min.
6. Ripetere i passaggi 4,2-4,4
7. Disidratare attraverso il seguente schema posologico (5 minuti ciascuno):
   • 30% di etanolo
   • Etanolo al 50%
   • Etanolo al 70%
   • 80% di etanolo
   • 90% di etanolo
   • 100% di etanolo
   • 100% di etanolo
   • 100% di etanolo
8. Trasferimento di copertura scivola in asciugatrice punto critico e campioni secchi.
9. Superficie mano di campione con 5nm platino / carbonio con evaporatore strato sottile strato

5. Rappresentante dei risultati:

Il metodo di isolamento produce di solito non stimolate neutrofili vitali con una purezza superiore al 95%. Quando fisso in diversi momenti dopo la stimolazione, il protocollo immunostaining mostra la sequenza di cambiamenti morfologici delle cellule durante NETosis appiattimento, la perdita di lobuli nucleare, la perdita di granulo e l'integrità nucleo che porta ad un crescente sovrapposizione di nucleare (cioè gli istoni) e granulare (cioè neutrofila) colorazione. Questo protocollo può servire come punto di partenza per analizzare le interazioni degli agenti patogeni specifici con neutrofili. Questa interazione può essere sezionato in maggior dettaglio utilizzando il protocollo di preparazione per la microscopia elettronica a scansione.

NET fluorescenza

Esempio di neutrofili stimolati colorate per NET (blu = DNA, rosso = istone, verde = neutrofila). Le immagini mostrano, oltre alla localizzazione NET, la localizzazione nucleare del DNA e istoni e il modello granulare per l'elastasi neutrofila.

SEM PMA stimolazione

Scansione al microscopio elettronico che mostra non neutrofili stimolati e PMA-stimolata. Dopo la stimolazione, i neutrofili appiattirsi e produrre NET.

NET SEM e Shigella

Maggiore risoluzione dell'immagine SEM del batterio Shigella intrappolati nelle reti.

Discussione

Il protocollo deve essere tale che l'isolamento di non neutrofili stimolati a notevole purezza, l'induzione della formazione del NET e l'analisi dei cambiamenti morfologici durante NETosis. Quando si maneggiano i campioni con cura, evitando cioè dure condizioni di lavaggio che comporta la perdita di gran parte delle reti debolmente attaccato, la quantità di formazione NET in condizioni di stimolazione differenti (durata, stimolo) possono essere confrontati. A questo proposito, i protocolli previsti può servire come punto di partenza per stabilire i metodi per analizzare gli scenari più sofisticati: le interazioni neutrofili / patogeno, sequenza di stimoli, interazione con altre cellule immunitarie.