רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

Summary

אנו מדווחים על שיטה הקדמה, מעקב וניתוח כמותי של ה-GFP ביטוי בתאי הצמח. שיטה זו משתמשת מערכת אישית מעוצבת רובוטיקה לאיסוף חצי תמונה רציפה של מספר גדול של דגימות, לאורך זמן. אנחנו גם מדגימים את השימוש ImageJ ו ImageReady ניתוח של סדרת תמונות.

Abstract

התבטאות גנים ברקמות הצמח הוא למד בדרך כלל על ידי מיצוי ההרסנית של תרכובות מרקמות הצמח

Protocol

המתודולוגיה הבאה מתארת ​​פרוטוקול לניתוח תמונה של ביטוי גנים באמצעות מערכת אוטומטית לאיסוף התמונה. על מנת להקל על ההסבר, הגישה הכללית הייתה מחולקים ארבעה שלבים: 1) הכנה זרע, 2) מבוא הגן באמצעות הפצצה החלקיקים, 3) אוסף תמונה רובוטית, 4) ניתוח התמונה. אף על פי מתודולוגיה זו בכלל יכול לשמש למגוון רחב של יישומים אחרים, קובע את ההווה של פרוטוקולים המבוססים על שימוש הגן חלבון הפלואורסצנט הירוק (GFP), המהווה גן הכתב שימושי ביטוי גנים למעקב אחר פיסת אותו של רקמה חיה לאורך זמן.

I. הכנה זרע

1. שעועית לימה (. Phaseolus lunatus קורות חיים הנדרסון, בוש) זרעים ניתן לרכוש, או באופן אידיאלי שנקטפו מצמחים הגדלים בתא הגידול (50% לחות יחסית, 16 / 8 שעות אור: חושך, 25/23 ° C יום / לילה). לאחר הקטיף איכות הזרע יכול להיות מתוחזק על ידי זרעים אחסון ב -20 ° C.
2. הכן GA7 מכולות מגנטה עבור נובטת זרעים. מקפלים נייר לסנן או מגבות נייר להשתלב התחתון של תיבות מגנטה. הוסף ~ 25 מ"ל מים deionized למיכל כל כדי ללחלח מגבות נייר, ויוצקים את המים unabsorbed. החיטוי לחלח נייר המכיל תיבות עבור 20 דקות.
3. באמצעות צינורות 50 מ"ל צנטריפוגות חד פעמיות, לעקר הזרעים בתמיסה 10% אקונומיקה מסחרי (20 זרעים 20-40 מ"ל) עבור 20 דקות עם רועדת על שייקר gyratory ב 60 סל"ד.
   הערה: כל הצעדים הבאים יש לבצע במנדף זרימה למינרית.
4. יש לשטוף את הזרעים 4-7 פעמים במים סטריליים deionized עם תסיסה עדינה במשך 30 שניות במהלך כל שטיפה.
5. מקום 5-6 זרעים עקרים בין שכבות של נייר מקופל נמצא כל תיבה מגנטה סטרילית.
6. דגירה זרעים במשך 4 ימים בתנאים הבאים: 25 ° C, 16 / 8 שעות אור: כהה 40 μEm ^-2 s ^-1.

השנייה. ג'ין מבוא ההפגזה באמצעות חלקיקים

1. בנה בונה גן באמצעות וקטור הביטוי האהוב עליך עם הגן כתב כי ניתן לפקח על רקמות חיות. יש לנו מהונדסים עותק גבוהה במספר וקטור ביטוי שימושי עבור היזם אלמנט מנתח האמרגן. וקטור זה מכיל את הגן GFP המשמש לדמיין האמרגן / אלמנט מקדם תפקוד ברקמות טרנספורמציה.
2. בסביבות 1-2 שעות לפני, הפגזה הבלו cotyledons לימה שעועית נובטת מתוך שתילים ולהסיר את המעילים זרע. Cotyledons מתאים הפצצה צריך להיות צהוב אור ירוק, שטוח ללא נזק העלול להפריע ניתוח התמונה עוד יותר.
3. המקום cotyledons על בינוני תרבות OMS המכיל מלחים MS ^1, ויטמין B5 ^2, סוכרוז 3% Gelrite 0.2% (pH 5.7) מיד לאחר נכרת.
4. משקע ה-DNA לבנות על M10 חלקיקי טונגסטן (Sylvania, Towanda, פנסילבניה, ארה"ב). בתוך צינור 0.6 microfuge מ"ל, להוסיף 25 חלקיקי הטונגסטן μl (חלקיקים הם resuspended במים סטריליים, 100 מ"ג מ"ל ^-1, ממש לפני השימוש), 5-DNA μl (1 μl ^-1 מיקרוגרם), 25 כלוריד μl 2.5 M סידן (Sigma אולדריץ חתול. C3881-500 גרם) ו - 10 μl 100 מ"מ spermidine (חתול סיגמא. S-2626). וורטקס בקצרה ביסודיות לערבב את כל המרכיבים.
5. דגירה הכנת ה-DNA על קרח למשך 5 דקות. לאחר מכן, להסיר ולסלק 50 supernatant μl.
6. Resuspend-DNA מצופה חלקיקי על ידי vortexing ומיד להסיר aliquot 2 μl. חזור על שלב זה vortexing בכל פעם aliquot יוסר הצינור. חלקיקים מצופים יש לשמור קרח בשימוש בתוך 15 דקות.
7. דרך החלק העליון של המסנן מזרק, מקום 2 חלקיקים מצופים μl באמצע המסך הסינון. הנח את יחידת המכיל מסנן חלקיקים מצופים ביחידה מחזיק המסנן בתוך החדר רובה החלקיקים.
8. מניחים שעועית לימה בצד טבורית adaxial על לבלבל והמקום לבלבל את האקדח בחדר החלקיקים. לבלבל, אשר מורכב מסך נמס לתחתית הכוס, משמש כפלטפורמה לתמיכה רקמות במהלך ההפצצות.
9. להפציץ את רקמות באמצעות אקדח חלקיקים (ב מתודולוגיה זו, אנו משתמשים יבוא פשוטה וזולה החלקיקים Gun ^3, חזיר, נועד במעבדה שלנו) כדלקמן: א) לפתוח את שסתום המוביל הריק לפנות את החדר, ב) לאחר ואקום מגיע 760 מ"מ (30) כספית, להפעיל את סולנואיד ולשחרר את הליום כדי להניע את החלקיקים, ג) לאחר הפגזה החלקיקים, לסגור את שסתום קו ואקום לשחרר את הוואקום באמצעות שסתום הפליטה. הלחץ הליום משמש להאיץ חלקיקים הוא 50 PSI.
10. לאחר ואקום משתחרר, פתח את דלת החדר כדי לאחזר את cotyledons מופגז ולהחזיר את, טבורית בצד adaxial מעלה, עד בינוני תרבות OMS.
    
    הערה: לקבלת כימות ו פרופיל הביטוי, אנחנו בדרך כלל להפציץ לפחות שלוש cotyledons DNA עבור כל מבנה. פקד חיובית, שהיא בדרך כלל ה-DNAלבנות שנותן למד היטב הביטוי פרופיל גנטי, נכלל כנקודת התייחסות.

ג. תמונה אוטומטי אוסף

1. להדליק את מנורת כספית ולהמתין 30 דקות עבור המנורה להתחמם.
2. הפעל את מקורות הכוח של Spot-RT מצלמת CCD (אבחון מכשירים בע"מ, סטרלינג הייטס, MI, ארה"ב) ואת המנוע פלטפורמה רובוטיקה בקר, אשר מניע את התנועה של פלטפורמת רובוטיקה.
3. הגדר את מערכת הסינון של גילוי ה-GFP (GFP2 להגדיר מסנן:.. אקס ננומטר 480/40, 510 Em LP) על מיקרוסקופ MZFLIII לנתח (לייקה, Heerbrugg, שוויץ).
4. לעקר את מעובה פוליקרבונט מכסים בצלחת פטרי על ידי ריסוס עם אתנול 70%. מכסים מיוחדים, נהגו לכסות את בסיס צלחת פטרי למנוע התעבות במהלך איסוף תמונה ^4.
5. מניחים את צלחות המכילות cotyledons מופגז על פלטפורמת רובוטיקה (Arrick רובוטיקה, הרסט, טקסס, ארה"ב) של מערכת אוטומטית תמונה אוסף. הפלטפורמה רובוטיקה הוא מונע על ידי מנוע להגדיר דריכה והוא מורכב שולחן עבור התקשרות של 8 צלחות פטרי. הפלטפורמה בנויה פוליקרבונט, פוליפרופילן ואלומיניום. פלטות מהודקים בעמדה ידי הידוק פלסטיק לרוחב הגדרת בורג.
6. פתח את יישום התוכנה מותאמת אישית השולט הן פלטפורמה רובוטיקה רכישת התמונה. כמו כן, לפתוח את מתג האור הלבן תוכנה בקר.
7. בכרטיסייה "תנועה מוטורית", לחץ על "המנוע" ו "הבית הנייד". לאחר התוכנה מכוונת את הפלטפורמה למצב בבית, אנחנו מוכנים להתחיל להזין עמדות עבור כל טבורית.
8. בכרטיסייה "תנועה מוטורית", בחר את הצלחת הראשונה. הפלטפורמה תהיה עמדה במרכז צלחת פטרי תחת המטרה של המיקרוסקופ. באמצעות לחצני מרחק זז, בדיוק בעמדה טבורית הראשון עבור אוסף תמונות. עם הבקר אור לבן על האזור היעד ניתן לראות דרך צג המחשב על ידי הפעלת תכונת "לחיות במצב".
9. עבור טבורית הראשון, להגדיר את המיקוד הגדלה (הגדלה 1.6x עדיפה) באמצעות ידיות ידנית על המיקרוסקופ לנתח. פוקוס התאמות עבור cotyledons שנותרו בצלחת אותו מבוצעים באמצעות שלושה ברגים פילוס הממוקם מתחת כל צלחת, על פלטפורמת רובוטיקה.
10. לאחר באזור של עניין נקבע, לחץ על "הוסף עמדה זו" כפתור. התוכנה תוסיף את הקואורדינטות של האזור הזה להגיש לוח זמנים המיקום ואת פלטפורמת יחזרו במרכז הצלחת.
11. הגדרת תפקידים ולהתמקד לכל cotyledons הנותרים על צלחות באמצעות לחצני המרחק נע וברגים פילוס ידנית. אחרי הכל את הקואורדינטות של כל cotyledons כבר נכנסו, לשמור את לוח הזמנים קואורדינטות המיקום.
12. הזן את אוסף הפרמטרים התמונה. בכרטיסייה "הגדרות תמונה", בחר את סוג האור הרצויה; לבן או כחול. לגילוי ה-GFP, רק האור הכחול אמור לשמש. כמו כן, הזן את ההגדרה חשיפה. למרות שאנו יכולים לשנות את זמן החשיפה באופן עצמאי עבור צבע אדום, כחול וירוק, אנו משתמשים בדרך כלל באותן הגדרות עבור GFP צילום ותיעוד (20, 14 ו - 14 שניות אדום, ירוק וכחול ערוצים, בהתאמה), מה שמאפשר לנו לבצע ישיר השוואות בין עקבי בונה DNA שונים.
13. בכרטיסייה אותו "הגדרת תמונה", ציין תיקיה ריקה שם את התמונות יישמרו. כל סדרה של תמונות יישמר בתיקייה זו אדון בתיקיות עצמאית, ממוספרים ברצף לפי סדר עמדות נכנס עבור cotyledons.
14. עבור אל "זמן לתפוס שליטה" הכרטיסייה ולהגדיר את רכישת התמונה מרווח הזמן ואת המספר הכולל של מחזורים של אוסף התמונות. תמונות נאספים בדרך כלל כל שעה במשך שעות 100, שהניבו מוגדרים היטב ביטוי הגן פרופילים.
15. התחל רכישת התמונה על ידי לחיצה על "לוח זמנים לרוץ!" כפתור הממוקם על הכרטיסייה "עמדה בלוח הזמנים".
16. בסוף האוסף h 100 תמונות, להעביר את כל התמונות מהמחשב שליטה על רובוט לנהוג כל קיבולת גדולה הקשיח של המחשב או לניתוח תמונה נוספת. תמונות ברזולוציה גבוהה (1600 x 1200 פיקסלים) נאספים כקבצי TIF מדידה ~ 5 מגה כל אחד.

IV. ניתוח תמונה

1. להרכיב את 100 התמונות רציפים מכל תיקייה באמצעות Adobe ImageReady.
   1. פתח ImageReady ולייבא את כל התמונות רציפים להלחין סדרה כמו מסגרות.
   2. שינוי גודל התמונות המקוריות עד 800 x 600 פיקסלים. תמונות שנאספו הם ברזולוציה גבוהה, אשר יוצרת קבצים גדולים אשר יכול להפוך את עיבוד תמונה איטי.
   3. דפדף בתמונות ולמצוא מקום (ים) גלוי ברוב התמונות.
   4. זום של עד 300% על המקום הנבחר (ים). יישור של תמונות באמצעות הגדלה גבוהה מאפשר רישום מדויק יותר.
   5. הוספת שכבה על גבי כל התמונות ולוודא גלוי כל המסגרות. מארק (ים) נקודה מיקום באמצעות הכלי "מכחול".
   6. התחל יישור כל המסגרות באמצעות הכלי "לנוע" ולקחת את הסימנים על שכבת כנקודת התייחסות.
   7. כאשר יישור תושלם, למחוק את שכבת המשמשים כנקודת התייחסות ולשמור תמונות כקובץ יחיד "PSD". כמו כן, לייצא את כל מסגרות כמו קובץ יחיד "mov" באמצעות הרזולוציה הגבוהה ביותר. יישור ידני של כל סדרה תמונה לוקח ~ 10 דקות.
2. בצע כימות של ביטוי גנים באמצעות ImageJ.
   1. פתח תוכנה ImageJ ופתח את "mov" קובץ שנשמר בעבר ב ImageReady.
   2. באמצעות הכלי בחירה, בחרו 400 x 300 פיקסלים אזור לחתוך את התמונה. קובץ חדש זה צריך להיות נשמר כמו קובץ "avi".
   3. הפרד את התמונות רציפים, נמצא את הקובץ החדש "אבי" לאפיקים אדום, כחול וירוק ידי לחיצה על "תמונה", "צבע" ו "לפצל RGB" ב ImageJ.
   4. הפחת את הקרינה רקע מכל התמונות בערוצי ירוק ואדום. באמצעות סדרה בערוץ הירוק תמונה, בחר 20 x 20 באזור פיקסל מאזור עם אי הבעת תאים שיא מיקומו הכלי "מנהל ההחזר על ההשקעה", כך אותו אזור ייבחרו בערוצים שניהם. עם מרובע 20 x 20 פיקסלים פעיל במסלול הירוק, עבור הפקודה "plugins" הממוקם בשורת המשימות של ImageJ ולאחר מכן לחץ על "ההחזר על ההשקעה לחסר נמדד עבור כל פרוסה" תוסף כלי.
   5. ב ImageJ, לחץ על "תמונה", "להתאים" ולאחר מכן "הסף" כדי להגדיר או במגזר ה-GFP-לבטא פיקסלים. התאם את רמות הסף על ידי גרירת שורת בחלון סף להשיג גודל נקודה ממוצע של 20-30 פיקסלים.
   6. קביעת ביטוי של GFP באמצעות תוסף שאנחנו תוכנן כדי למדוד מתכוון בגווני אפור ערך לפיקסל ואת המספר הכולל של ה-GFP-לבטא פיקסלים.
   7. העתק את הפלט אומר grayscale ערכים ImageJ ולהדביק לתוך Microsoft Office Excel. חישוב ביטוי ה-GFP לכל ערוץ (אדום וירוק) על ידי הכפלת ממוצע בגווני אפור ערך לפיקסל במספר הכולל של ה-GFP-לבטא פיקסלים עבור כל ערוץ. סכום הערכים ביטוי בשני הערוצים נותן ביטוי של GFP. ערכים ניתן להשתמש כדי להמחיש את הביטוי פרופילים גנים לערוך השוואות ישירות. זמן לשגות אנימציות יכול להיווצר גם באמצעות "mov" או "אבי" קבצים, מספקים ראיה ייחודית וברורה של הפרופיל ביטוי גנים.

V. תוצאות נציג

אוסף תמונות ניתוח רובוטיים הליך (איור 1) דיווח כאן מאפשר רכישה של כמות גדולה של נתונים כמותיים על ביטוי גנים בתקופת זמן קצרה. לאפיון הצמח מקדם באמצעות גן ה-GFP, מתודולוגיה זו היא לא רק שימושי ליצור פרופילים ביטוי חולף (איור 2), אלא גם לעקוב אחר בביטוי באופן מפורט ב-GFP transiently-ורקמות הצמח ביציבות, הפך ^5,6. קצר זמן לשגות אנימציות שנוצר עם תמונות רציפים שנאספו הם כלי רב ערך עבור מעמיק ומנתח של ביטוי גנים על פני זמן ברקמות הצמח. מתודולוגיה זו יש גם יישומים גדולים להעריך גורמים המשפיעים ישירות על ביטוי גנים. לדוגמה, ביטוי של GFP חולף תחת נוכחות של מדכאי שונים של השתקה ממקור נגיפי נחקרה בהצלחה באמצעות אוסף תמונה האוטומטית שלנו ומערכת ניתוח ^7,8.

באיור 1. ניתוח הליך תמונה מורכבת מארבעה שלבים עיקריים. (א) רכישת סדרה התמונה באמצעות תמונה רובוטית אוסף המערכת, (ב) הפרדת תמונות לאפיקים אדום, כחול וירוק, (ג) פילוח של פיקסלים להביע באמצעות התאמת רמות הסף, ו (ד) קבלת תוצאות פלט המכיל את ערכי גווני אפור ו-GFP להביע ספירת להתמקד.

איור 2. גרף המציג פרופילים שונים ביטוי חולפת נהוגה בידי היזמים צמח התמזגו GFP. הנתונים נאספו באמצעות אוסף מערכת רובוטית שלנו התמונה ניתח עם ImageReady ותוכנה ImageJ.

Discussion

השימוש ברובוטיקה יש יישומים עצום היבטים שונים של חיי האדם, במיוחד, רובוטים שימשו ביעילות לבצע פעולות בסביבה מסוכנת, כדי להפוך פעילות מייגע ומורכב, וכדי לבצע משימות באופן מדויק יותר. בביולוגיה מולקולרית, ובמיוחד ביטוי מנתח גן, רובוטים יכולים לעזור לעקוב לא רק תכונות של גנים, אלא גם לצמיחה של רקמה ופיתוח לאורך זמן. תופעות ביולוגיות רבות מתרחשות באופן דינמי, אשר עשוי להיות קשה לעקוב באמצעות נקודה אחת התצפיות זמן.

השימוש של הגן GFP ללימודי הביטוי מביא יתרונות נוספים עבור צפייה בתגובה רקמות וצמיחה. עבור פרוצדורות הניסוי שלנו, GFP מאפשרת לנו לעקוב אחר ביטוי גנים אותה פיסת רקמה לאורך זמן כמו גילוי ה-GFP הוא הרסני. יתר על כן, הגרסה שלנו של חלבון ה-GFP היא יציבה מספיק כדי לאפשר זיהוי, אלא גם מראה כמה מחזור כדי למזער את הצטברות ברקמות צמח, המאפשר לנו לעקוב גם את עלייתה ונפילתה של ביטוי גנים.

יש לנו כבר אוסף מנוצל תמונה רובוטית שלנו מערכת ניתוח עבור מגוון רחב של יישומים. אנו צופים פוטנציאל גבוה עבור יישומים ביולוגיים רבים בהם הבנה דינמית של תופעה הוא הרצוי. לדוגמה, צמיחה והתפתחות של רקמות הצמח ניתן לעקוב באמצעות המערכת שלנו נותנת תובנה חשובה / מידע על תהליכים אלה. כמו כן, הדינמיקה של חלבון הובלה באמצעות הגנים הכתב כמו ה-GFP, ניתן דמיינו בקלות באמצעות זמן לשגות אנימציות. המתודולוגיה שתוארו בדו"ח זה הוא מורכב טכנית, אבל פשוטה מבחינה מושגית. התוצאות שלנו הם חזקים ויישומים חדשים ממשיכים להתגלות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ	Software	National Institutes of Health		http://rsbweb.nih.gov/ij/