המודל של טרשת עורקים Flow-induced מופרע על העורק הראשי עכבר ידי קשירת חלקי שיטה פשוטה של ​​בידוד RNA מן התרדמה האנדותל

Summary

זה מתאר ניתוח חלקי קשירת הראש, מה שגורם תנאי הזרימה מופרע והתפתחות טרשת עורקים הבאות (בעוד שבועיים) עם כלי דם, ניאו intraplaque (ארבעה שבועות) בעורק התרדמה המשותף העכבר. כמו כן, אנו מתארים שיטה חדשה של בידוד RNA מן התרדמה אינטימה, מתן RNA הטוהר גבוהה האנדותל.

Abstract

למרות העמותה הידועה קרוב, ראיות ישירות לקשר לזרום מופרע כדי atherogenesis כבר חסר. השתמשנו לאחרונה גירסה שונה של הראש שיטות קשירת חלקית [1,2] להראות כי בחריפות גורם התנאים תזרים נמוך oscillatory, שני מאפיינים מרכזיים של זרימת מופרע, בעורק התרדמה המשותף העכבר. באמצעות מודל זה, יש לנו עדות ישירה כי הזרימה מופרע אכן מוביל להתפתחות טרשת עורקים מהירה חזקים עכבר נוקאאוט אפוליפופרוטאין E [3]. אנחנו גם פיתח שיטה של ​​הכנה RNA אנדותל עם הטוהר גבוהה מן התרדמה עכבר אינטימה [3]. שימוש במודל עכבר שיטה, מצאנו כי קשירת גורם חלקי תפקוד אנדותל תוך שבוע, ואחריו היווצרות atheroma חזקים ומהירים בעוד שבועיים במודל של עכברים hyperlipidemic יחד עם תכונות של היווצרות נגעים מורכבים כגון neovascularization intraplaque על ידי ארבעה שבועות. זה מהיר

Protocol

1. קשירת חלקית של עורק התרדמה השמאלי

1. עכברים משמשים ~ 8 שבועות. המשקל של העכברים מומלץ להיות לפחות 18 גרם.
2. לחטא את המכשירים לשנייה 30 ב מעקר מכשיר חרוז ולאפשר להתקרר
3. להשרות הרדמה עם קטמין (80mg/kg) ו Xylazine (10mg/kg) intraperitoneal (IP) הזרקה או חלופה הרדמה כפי שאושר על ידי IACUC. עבור זריקה ip, להזריק עכבר ברבע נמוך השמאלי של הבטן.
4. המקום העכבר בתא התחממות עד מרדים לחלוטין. בדיקת עומק של הרדמה עם תגובה לצבוט הבוהן.
5. המקום העכבר על הבמה כירורגי, ב פרקדן (צד הבטן למעלה) עמדה. הקדמי-Tape כפות רגליו מעלה את הכפות האחוריות, היחידה עד הבמה.
6. החל כמות ליברלית של סוכן מקריח (למשל Nair) עד צוואר בין הלסת התחתונה ואת עצם החזה. עיסוי השיער בעדינות עד שכל מוסר.
7. נקו את סוכן מקריח וליישם כמות ליברלית של בבטאדין לאזור מקולף.
8. הכן 1 באורך שני סנטימטרים קטעי תפר 6-0 משי ligations. עכבר כל תצטרך שתי חתיכות של תפר.
9. בעזרת מספריים חדים קטן, לעשות חתך 4-6mm אנכי באמצע הצוואר. גם את העור ואת fascia הבסיסי צריך להיות לחתוך.
10. הזז את בלוטת הפרוטיד שנותר קו האמצע שמאלה ומתחילים בוטה לנתח בדיוק של קנה הנשימה. אתה אמור להיות מסוגל לזהות את הראש פועם משותף שמאל בקלות.
11. בצע את הראש הנפוצים caudally עד שתאתר את הסתעפות.
12. בבוטות לנתח את הסתעפות לחשוף את הבאים ארבעה סניפים דיסטלי את עורק התרדמה השמאלי משותף: העורק הראשי חיצוני, העורק הראשי הפנימי, עורק העורפית ואת העורק התריס מעולה. אלו כלי, בלוטת התריס מעולה במיוחד, יכול להיות שביר. תיזהר מאוד עם דיסקציה שלך.
13. לקשור את הראש חיצוני לעיל בלוטת התריס מעולה באמצעות 6-0 תפר משי. כדי לעשות זאת, במעבר אחד מלקחיים מתחת העורק לתפוס פיסת תפר שנחתך מראש פוזרו בעזרת מלקחיים אחרים שלך. משוך בעדינות את תפר לעבור מתחת העורק. עניבה בתקיפות להימנע מכל הרקמה שמסביב להיתפס בתוך הקשר. אם אתה לקשור מתחת לחלוץ של העורק התריס מעולה, בסופו של ההליך יהיה יעיל ביצעו קשירת שלם אשר הוא מודל שונה מהותית.
14. לקשור את עורקי הראש ועל העורף פנימי עם קשר אחד באמצעות באותה טכניקה.
15. ודא מיקום התפרים ואת patency של העורק התריס מעולה.
16. עור משוער ועל העור קרוב באמצעות כמות קטנה של רקמות לתקן.
17. המקום עכברים בתא התחממות עד להחלמה. השחזור בדרך כלל לוקח 30 עד 60 דקות.
18. מינון יחיד של עצירות (0.1mg/kg) צריכה להינתן מיד לאחר ניתוח אם הרדמה המשמשים אינו מספק הקלה על כאב ממושך (כלומר isoflurane בשאיפה) או אם בעל החיים נמצא במצוקה בתוך 24 השעות הראשונות. מניסיוננו, המינון קטמין מנוהל עבור הרדמה מספק שיכוך כאבים מספיק כאשר הניתוח מבוצע על ידי מנתח מנוסה ואין כאבים נוסף נדרש.

2. הראש בדיקת אולטרסאונד

1. כדי לאמת אם קשירת חלקית המושרה מופרע זרימה, זרימה הראש יש לבחון יום אחד לאחר קשירת
2. להשרות הרדמה עם isoflurane - תיבת אינדוקציה הרדמה יכול לשמש במידת הצורך
3. המקום בעכברים מורדמים על הבמה הדמיה, בצד הבטן למעלה
4. קלטת הידיים והרגליים כדי א.ק.ג. חיישן על הבמה הדמיה
5. להשיר הצוואר ידי יישום ליברלית של נאיר (צעד זה נחוץ רק אם לא עשית הליך קשירת)
6. הכנס מדחום רקטלי להקליט טמפרטורה
7. החל אקו ג'ל על הצוואר
8. התחל במצב-B.
9. מטוס הדמיה צריכה להיות 90 מעלות (כפתור על בדיקה צריך להצביע לכיוון האף של העכבר)
10. בדיקה התחתון על הצוואר העכבר עד התמונה מתקבלת.
11. מניפולציות הבמה על ימין ועל שמאל עד לקנה הנשימה (אמצע קו המבנה) מזוהה
12. זיהוי שמאל העורק הראשי משותף
13. בשלב הדמיה הטיה כך בזווית שנוצר בין מטוס הדמיה ואת הראש. ככל שגדלה זווית זו, האות חזק דופלר יהיה.
14. המקום הדופק גל דופלר באמצע של עורק התרדמה המשותף משמאל.
15. השתמש תיקון זווית כנדרש.
16. חזור על מדידות על הראש המשותף הנכון.
17. מוצלח קשירת הראש חלקית תגרום להפחתה כוללת בזרימה (~ 80-90%) של עורק התרדמה המשותף שמאל בהשוואה לצד ימין, עם היפוך זרימת לקראת כניסת אבי העורקים במהלך דיאסטולה.
18. ברגע תמונות משביע רצון הושגו, לכבות הרדמה, לנגב את הד ג'ל עכברים בעכברים ללא מיל קלטתtraints. המקום עכברים בחדר התאוששות חימם.

3. Intimal RNA במנותק מן התרדמה

1. הקורבן עכברים משאיפת CO ₂ על פי פרוטוקול IACUC מוסדיים
2. הקלטת הכפות על מגבת נייר.
3. חותכים את העור של העכבר מהבטן לחלק העליון של החזה.
4. פתח את דופן הבטן מתחת בית החזה עם זוג מספריים חדות.
5. הרם את החזה עם מלקחיים חתך את הסרעפת, ואז לחתוך את בית החזה כדי לחשוף את הלב.
6. חותכים את הווריד הנבוב במספריים.
7. לחץ perfuse (120 מ"מ כספית) במשך 2-3 דקות עם מלח רגיל המכיל 10 יחידות / מ"ל ​​הפרין דרך החדר השמאלי עד הריאות והכבד להיות חיוור.
8. חותכים את עור הצוואר ולהסיר את כל השומן, השרירים, רקמות החיבור עד עורקי הראש חשופים.
9. מניחים את העכבר תחת מיקרוסקופ לנתח.
10. לנקב חור ממש מתחת האתרים של קשירת עורק התרדמה השמאלי עבור זלוף השני.
11. לחץ perfuse שוב דקות ~ 1 עם מלח רגיל המכיל 10 יחידות / מ"ל ​​הפרין דרך החדר השמאלי, מוודא הצוואר השמאלי לעיונו היטב.
12. בעזרת מלקחיים קצה בסדר ומספריים באביב קטן, בזהירות להסיר את peri-adventitial הרקמות הסובבות את העורקים הראשיים. היזהרו לא למתוח או לסחוט את העורק הראשי במהלך שלב זה ניקוי.
13. חותכים את העורק הראשי השמאלי בין קשת אבי העורקים ונקודות קשירת הסתעפות מעל הראש.
14. חותכים את העורק הראשי הנכון בין נקודת העורק הימני subclavian הסתעפות הסתעפות ואת הראש.
15. העברת את העורק הראשי אל צלחת 35 מ"מ תרבות, המכיל קר כקרח HBSS. במידת הצורך, להסיר בזהירות כל רקמה הנותרת peri-adventitial.
16. הכן מזרק אינסולין (10/03 מזרק מ"ל) עם מחט 29g ידי מילוי עם 150 חיץ תמוגה μl QIAsol (Qiagen) לכל הראש כל אחד.
17. בזהירות להכניס קצה מחט לתוך קצה אחד של הראש.
18. בעוד מחזיק את הראש וקצה המחט עם מלקחיים, במהירות (~ 1 שניות) לרוקן את המאגר תמוגה QIAsol (150 μl) לתוך צינור 1.5ml (eluate אינטימה).
19. שוטפים את שאריות התרדמה (מדיה + adventitia) פעם HBSS, לשים אותו צינור 1.5 מ"ל, ו - Snap-הקפאה בחנקן נוזלי.
20. Eluate אינטימה ואת שאריות קפוא משמשים עבור intimal או אמצעי בידוד + RNA adventitia באמצעות miRNeasy מיני קיט (QIAGEN) על פי הוראות היצרן.

4. נציג תוצאות:

אנו ligated חלקית העכבר השמאלי עורקי הראש ובדיקת אולטרסאונד בוצע יום אחד לאחר ההליך. כפי שניתן לראות בתרשים 1, קשירת חלקית מוצלחת מפחית את זרימת הדם, מהירות הזרימה מתהפך (זרימה מופרעת) בעורק התרדמה המשותף משמאל במהלך דיאסטולה. קשירת חלקית של ApoE (KO) עכברים knockout מלווה דיאטה שומן גבוה גורם לטרשת עורקים חזקים בעורק התרדמה המשותף משמאל (רע"א), אבל לא התרדמה הימני הנגדי, של שבועיים (איור 2). RNA שנאספו אינטימה הראש מכיל גנים סמן אנדותל כגון PECAM-1, בעוד ללא המדיאלי חלקה תא שריר גנים סמן כגון SMA-a (איור 3).

איור 1: סכמטי של אנטומיה ligations הראש: שלושה סניפים של עורק התרדמה השמאלי המשותף (רע"א) [חיצוני העורק הראשי (ECA), עורק התרדמה הפנימי (רשפ"ת), ואת העורק העורפית (OA)] היו ligated, תוך השארת את העורק התריס מעולה (STA) פתוח.

איור 2: תמונות אולטרסאונד להראות פרופילים מהירות זרימה עולה, כי קשירת גורם חלקי היפוך זרימה (מסומנת בחצים) ברע"א במהלך דיאסטולה. זרימה RCA נותר ללא שינוי לאחר קשירת.

איור 3: קשירת חלקית ו עתירי שומן דיאטה במהירות גורם לטרשת עורקים ברע"א של עכברים KO ApoE ApoE עכברים KO היו ligated חלקית והאכילו את דיאטה עתירת שומן 1 עד 3 שבועות.. חלקים קפואים רע"א הוכתמו שמן אדום-O.

איור 4. שיטת הכנה RNA intimal. RNA Intimal ו המדיאלי + adventitial (מ + א) RNA התקבלו דמה פעולה RCA ו רע"א ב C57BL / 6 עכברים. RNAs נותחו על ידי וכמותיות RT-PCR (א) ו qPCR (B, C) ​​עבור PECAM-1 ו-α-SMA באמצעות 18s כמו שליטה פנימי. גרפים בר הם ממוצע ± SEM, n = 3.

Discussion

בהליך זה, זיהוי נכון של כל הענפים של עורק התרדמה המשותף כולל התרדמה החיצוני, עורק התרדמה הפנימי, עורק העורפית ואת העורק בלוטת התריס מעולה היא חיונית. חשוב גם לבדוק את תבנית הזרימה באמצעות אולטרסאונד כמו הדגים. בידיים שלנו מנוסים, שיעור ההצלחה של ניתוחים שלנו קשירת חלק...

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Normal Saline (0.9% sodium chloride)		Baxter	2B1323
Insulin syringe (3/10 ml 29g syringe)		Tyco Health care	8881600145
HBSS		Cellgro, Mediatech, Inc.	21-023
miRNeasy mini kit (including, QIAzol)		QIAGEN	217004
Vevo 770 High-Resolution Micro-Imaging System		Visualsonics	a.Visualsonics 770 system b.Imaging stage c.Vevo integrated rail system d.RMV scan head for mice	or similar system
6-0 Silk Suture, sterile		Covidien	s-1172 c2
Small scissors		Roboz	RS-5675	or similar
Dissecting Forceps		Roboz	RS-5005	or similar
Tissue Mend II		Webster Vet Supply	07-856-7946