Un modèle de Disturbed flux athérosclérose induite chez la souris artère carotide par ligature partielle et une méthode simple d'isolement d'ARN de l'endothélium carotidienne

Résumé

Ceci décrit une ligature partielle carotide, ce qui provoque des conditions d'écoulement perturbé et développement de l'athérosclérose ultérieure (dans deux semaines) avec intraplaque néo-vascularisation (en quatre semaines) chez la souris l'artère carotide commune. Nous décrivons également une nouvelle méthode d'isolement d'ARN à partir de l'intima carotidienne, fournissant ARN haute pureté endothéliales.

Résumé

Malgré l'association connue près, les preuves directes reliant écoulement perturbé à l'athérogenèse a fait défaut. Nous avons récemment utilisé une version modifiée de la carotide méthodes ligature partielle [1,2] pour montrer qu'il induit gravement les conditions de faible débit et oscillatoire, deux caractéristiques essentielles du flux perturbé, chez la souris l'artère carotide commune. En utilisant ce modèle, nous avons fourni des preuves directes qui en découlent perturbée conduit en effet au développement rapide et robuste athérosclérose chez la souris knockout apolipoprotéine E [3]. Nous avons également développé une méthode de préparation de l'ARN endothéliales avec une grande pureté de l'intima carotidienne la souris [3]. L'utilisation de ce modèle de souris et de la méthode, nous avons constaté que la ligature partielle entraîne une dysfonction endothéliale en une semaine, suivie de la formation d'athérome robuste et rapide de deux semaines dans un modèle de souris hyperlipidémiques ainsi que des fonctions de formation de lésions complexes tels que la néovascularisation intraplaque de quatre semaines. Ce rapide

Protocole

1. Ligature partielle de l'artère carotide gauche

1. Les souris sont utilisées à ~ 8 semaines d'âge. Le poids de la souris est recommandé d'avoir au moins 18 grammes.
2. Stériliser les instruments pour les 30 secondes dans le stérilisateur à l'instrument de perles et laisser refroidir
3. Induire une anesthésie à la kétamine (80mg/kg) et de xylazine (10mg/kg) anesthésie intrapéritonéale (ip) par injection ou alternative approuvée par IACUC. Pour une injection ip, injecter de la souris dans le quadrant en bas à gauche de l'abdomen.
4. Placez la souris dans une chambre de réchauffement jusqu'à ce que complètement anesthésiés. Vérifiez la profondeur de l'anesthésie avec réponse à pincement de l'orteil.
5. Placez la souris sur une scène chirurgicale, en position couchée (côté ventre) position. Tape la patte avant-paumes vers le haut et la semelle pattes arrière vers le bas pour la scène.
6. Appliquez la quantité d'agent dépilatoire libérale (par exemple Nair) au cou entre la mandibule et le sternum. Massez doucement jusqu'à ce que tous les cheveux sont enlevés.
7. Nettoyez l'agent à épiler et appliquer une quantité libérale de bétadine à la zone épilée.
8. Préparer 1 pouce de long sections de 6-0 suture de soie pour les ligatures. Chaque souris aura besoin de deux morceaux de fil de suture.
9. En utilisant une petite ciseaux pointus, faire une incision de 4 à 6 mm vertical dans le milieu du cou. Tant la peau et le fascia sous-jacents doivent être coupés.
10. Déplacer la glande parotide gauche de la ligne médiane vers la gauche et commencer carrément dissection juste à droite de la trachée. Vous devriez être capable d'identifier la pulsation carotidienne commune gauche facilement.
11. Suivez la carotide commune caudalement jusqu'à ce que vous localiser la bifurcation.
12. Carrément disséquer la bifurcation pour exposer les quatre branches distales de l'artère carotide commune gauche: l'artère carotide externe, l'artère carotide interne, artère occipitale et l'artère thyroïdienne supérieure. Ces navires, en particulier la thyroïde supérieure, peut être fragile. Soyez très prudent avec votre dissection.
13. Nouez la carotide externe au-dessus de la thyroïdienne supérieure en utilisant 6-0 suture de soie. Pour ce faire, passer une pince au-dessous de l'artère et de saisir un morceau de fil de suture prédécoupés avec l'aide de votre pince à d'autres. Tirez doucement sur la suture de passer en dessous de l'artère. Attachez solidement en évitant toute tissus environnants d'être pris dans le noeud. Si vous attachez-dessous du décollage de l'artère thyroïdienne supérieure, d'ici la fin de la procédure vous sera effectivement avoir effectué une ligature complète qui est un modèle sensiblement différent.
14. Nouez les artères carotides internes et occipital avec un noeud en utilisant la même technique.
15. Vérifiez la position des points de suture et la perméabilité de l'artère thyroïdienne supérieure.
16. Approximative de la peau et la peau à proximité en utilisant une petite quantité de tissu-Mend.
17. Souris Placer dans une chambre de réchauffement jusqu'à la guérison. Le rétablissement prend généralement 30 à 60 minutes.
18. Une seule dose de buprénorphine (0.1mg/kg) doit être administré immédiatement après la chirurgie si l'anesthésie utilisée ne fournit pas de soulagement de la douleur prolongée (ie. l'isoflurane en inhalation) ou si l'animal est en détresse dans les premières 24 heures. Dans notre expérience, la dose de kétamine administrés pour l'anesthésie fournit une analgésie suffisante lorsque la chirurgie est effectuée par un chirurgien expérimenté et aucun analgésique supplémentaire est nécessaire.

2. Échographie carotidienne

1. Pour valider si la ligature partielle induite perturbée débit, de débit carotidien doit être examiné un jour après la ligature
2. Induire une anesthésie avec l'isoflurane - boîte induction anesthésique pourrait être utilisée si nécessaire
3. Placez la souris anesthésiée sur scène l'imagerie, le côté du ventre jusqu'à
4. Ruban bras et les jambes à l'ECG du capteur sur scène l'imagerie
5. Défolier le cou par une application libérale de Nair (cette étape n'est nécessaire que si ce n'est déjà fait pour la procédure ligature)
6. Insérer un thermomètre rectal pour enregistrer la température
7. Appliquez un gel Echo au cou
8. Démarrer en mode B.
9. Plan d'imagerie doit être de 90 degrés (bouton sur la sonde doit pointer vers le nez de la souris)
10. Basse sonde sur le cou de la souris jusqu'à l'image est obtenue.
11. Manipuler étape de gauche et à droite jusqu'à la trachée (mi-ligne de structure) est identifié
12. Identifier artère carotide commune gauche
13. Stade de l'imagerie Tilt sorte qu'un angle est créé entre le plan de l'imagerie et la carotide. Plus cet angle, plus le signal doppler sera.
14. Placez impulsions Doppler au milieu de la carotide commune gauche.
15. Utiliser la correction d'angle, au besoin.
16. Répéter les mesures sur la carotide commune droite.
17. Succès ligature carotidienne partielle entraînera une réduction globale des flux (~ 80-90%) dans la carotide commune gauche par rapport à la droite, avec inversion des flux vers l'entrée aortique pendant la diastole.
18. Une fois les images satisfaisants ont été obtenus, éteignez l'anesthésie, essuyez l'écho de gel hors souris et souris sans res bandestraints. Placez la souris dans la chambre de récupération réchauffé.

3. Intima l'ARN isolement de la carotide

1. Sacrifice souris par inhalation de CO ₂ selon le protocole institutionnel IACUC
2. Bande les pattes d'une serviette en papier.
3. Coupez la peau de la souris de l'abdomen vers le haut du thorax.
4. Ouvrez la paroi abdominale en dessous de la cage thoracique avec une paire de ciseaux.
5. Soulevez le sternum avec une pince et couper la membrane, puis couper la cage thoracique afin d'exposer le cœur.
6. Couper la veine cave avec des ciseaux.
7. Perfuser pression (120 mmHg) pendant 2 à 3 min avec une solution saline normale contenant 10 unités / ml d'héparine dans le ventricule gauche jusqu'à ce que les poumons et le foie devient pâle.
8. Coupez la peau du cou et de retirer toute la graisse, les muscles et les tissus conjonctifs jusqu'au artères carotides sont exposés.
9. Placez la souris sous un microscope à dissection.
10. Crevaison un trou juste au-dessous des sites ligature de la carotide gauche pour la seconde perfusion.
11. Pression perfuser à nouveau pour ~ 1 min avec une solution saline normale contenant 10 unités / ml d'héparine dans le ventricule gauche, en veillant à la carotide gauche est bien lu.
12. En utilisant une pince à pointe fine et ciseaux petit ressort, retirer soigneusement les tissus péri-adventiciel entourant les carotides. Attention à ne pas presser ou étirer les carotides pendant cette étape de nettoyage.
13. Couper l'artère carotide gauche entre la crosse de l'aorte et les points ci-dessus ligature de la bifurcation carotidienne.
14. Couper l'artère carotide droite entre le point artère sous-clavière droite de branchement et de la bifurcation carotidienne.
15. Transfert des carotides à une boîte de culture de 35 mm, contenant glacée HBSS. Si nécessaire, retirez soigneusement toute restantes péri-adventiciel tissus.
16. Préparer une seringue à insuline (seringue de 3 ml / 10) avec une aiguille 29g en remplissant avec 150 tampons QIAsol lyse ul (Qiagen) pour chaque carotide.
17. Insérez soigneusement la pointe de l'aiguille à une extrémité de la carotide.
18. Tout en tenant la carotide et la pointe de l'aiguille avec une pince, rapidement (~ 1 sec) rincer le tampon de lyse QIAsol (150 pl) dans un tube de 1.5ml (éluat intima).
19. Rincer les restes de la carotide (médias + adventice) une fois dans HBSS, le mettre dans un tube de 1,5 ml, et enclenchez-gel dans l'azote liquide.
20. Intima éluat et les restes congelés sont ensuite utilisées pour l'intima média ou de l'isolement adventice + ARN en utilisant l'miRNeasy mini kit (QIAGEN) selon les instructions du fabricant.

4. Les résultats représentatifs:

Nous partiellement ligaturée gauche de la souris artères carotides et l'échographie a été effectuée un jour après la procédure. Comme le montre la figure 1, le succès ligature partielle réduit la vitesse du flux sanguin et inverse de flux (flux perturbé) dans l'artère carotide commune gauche durant la diastole. Ligature partielle de l'ApoE KO (KO) accompagné d'une souris régime riche en graisses provoque l'athérosclérose robuste dans l'artère carotide commune gauche (ACV), mais pas dans la carotide droite controlatéral, par deux semaines (figure 2). ARN recueillies auprès de l'intima carotidienne contient des gènes marqueurs endothéliaux tels que PECAM-1, alors libre de gènes médial du muscle lisse marqueur de cellule comme un SMA-(figure 3).

Figure 1: Schéma de l'anatomie carotides et des ligatures: Trois branches de l'artère carotide commune gauche (ACV) [artère carotide externe (CEA), l'artère carotide interne (ACI), et l'artère occipitale (OA)] ont été ligaturés, tout en laissant l'artère thyroïdienne supérieure (STA) ouvert.

Figure 2: Les images de l'échographie montre des profils de vitesse de débit et de révéler que la ligature partielle induit inversion de flux (indiquées par des flèches) dans l'ACV pendant la diastole. Débit en RCA reste inchangé après la ligature.

Figure 3: ligature partielle et à haute teneur en graisses induit rapidement l'athérosclérose chez des souris KO LCA ApoE ApoE souris KO ont été partiellement ligaturée et nourris avec le régime riche en graisses pendant 1 à 3 semaines.. Des sections congelées de LCA ont été colorés avec l'huile rouge-O.

Figure 4. Méthode de préparation de l'ARN intimale. Intimale et médiale ARN + adventiciel (m + a) ARN ont été obtenus à partir opération fictive RCA et dans la LCA souris C57BL / 6. ARN ont été analysés par des semi-RT-PCR quantitative (A) et qPCR (B, C) ​​pour PECAM-1 et α-SMA utilisant 18 comme contrôle interne. Les graphiques à barres sont des moyennes ± SEM, n = 3.

Discussion

Dans cette procédure, l'identification correcte de toutes les branches de la carotide commune, y compris la carotide externe, la carotide interne, artère occipitale et l'artère thyroïdienne supérieure est essentielle. Il est également important de vérifier la configuration de l'écoulement en utilisant des ultrasons comme l'a démontré. Dans nos mains expérimentés, notre taux de succès des chirurgies ligature partielle sur la base des études de l'échographie de plus de 500 souris est sup...

matériels

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Normal Saline (0.9% sodium chloride)		Baxter	2B1323
Insulin syringe (3/10 ml 29g syringe)		Tyco Health care	8881600145
HBSS		Cellgro, Mediatech, Inc.	21-023
miRNeasy mini kit (including, QIAzol)		QIAGEN	217004
Vevo 770 High-Resolution Micro-Imaging System		Visualsonics	a.Visualsonics 770 system b.Imaging stage c.Vevo integrated rail system d.RMV scan head for mice	or similar system
6-0 Silk Suture, sterile		Covidien	s-1172 c2
Small scissors		Roboz	RS-5675	or similar
Dissecting Forceps		Roboz	RS-5005	or similar
Tissue Mend II		Webster Vet Supply	07-856-7946