Electrofusion Cell דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Summary

בסרטון הזה אנחנו מדגימים electrofusion יעילה של תאים במבחנה באמצעות שיטה הדבקות שונה באמצעות electroporation ואת גילוי מאוחר של ראיה התאים התמזגו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Abstract

Electrofusion Cell היא שיטה בטוחה, לא ויראלי ולא כימי שיכול לשמש להכנת תאים היברידית לטיפול אנושי. Electrofusion כולל יישום של מתח גבוה בפולסים קצרים חשמליים לתאים הנמצאים במגע קרוב. יישום קצר, מתח גבוה פולסים חשמליים גורם היציבות של ממברנות פלזמה התא. ממברנות ערער הם חדירים יותר עבור מולקולות שונות ונוטים גם איחוי הקרומים ערער עם כל השכנים. Electrofusion הוא אפוא דרך נוחה להשיג היתוך הלא ספציפית של תאים שונים מאוד

Protocol

אני טוען את התאים עוקבים Cell CMFDA ו CMRA

1. ניסויים שבוצעו על תאים שהוכנו בעבר שורה של מלנומה תא העכבר (B16-F1). התאים גדלים בשני מופרדות 25 ס"מ ² צלוחיות תרבות (TPP, ZDA) כדי מפגש 70-80% במדיום תרבות DMEM (מדיום שונה Dulbecco של הנשרים) בתוספת סרום 10% שור עוברית, 0.15 מ"ג / מ"ל L-גלוטמין, 16 מ"ג / ml גנטמיצין (כולם סיגמא אולדריץ, גרמניה), 200 יחידות / מ"ל crystacillin (Pliva, קרואטיה), ו מודגרות ב 5% CO ₂ ב 37 ° C.
2. להכין שתי מניות 10 mM פתרונות של עוקבים Cell (Invitrogen, ארה"ב) על ידי הוספת 10.76 μl ו 9 μl (עבור גרין CMFDA עבור אורנג' CMRA, בהתאמה) של DMSO (סיגמא אולדריץ, גרמניה) עד 50 מיקרוגרם של צבע במקור Invitrogen בקבוקון. הפתרון המניה ניתן לאחסן במקרר ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. לפני שמתחילים את הניסויים, לחמם את הפתרון עד גבישים של DMSO להתמוסס.
3. הכן ביקרבונט ללא קרבס-Hepes חיץ (130 mM NaCl, KCl mM 4.7, 1.2 mM MgSO _4, 1.2 mM KH ₂ PO _4, 11.7 מ"מ D-גלוקוז, 1.3 mM CaCl _2, 10 HEPES מ"מ, pH 7.4). בשני 15 מ"ל Eppendorf צינורות בנפרד לערבב 2.1 μl של כל פתרון המניות (10 mM CMFDA או CMRA, בהתאמה) מ"ל 3 של חיץ קרבס-Hepes ביקרבונט חינם. זה מניב "פתרון טעינת" המכיל כ 7 מיקרומטר CMFDA (או CMRA).
4. יש לשטוף את התאים פעמיים עם חיץ קרבס-Hepes ביקרבונט חינם ולאחר מכן הכנס טעינת פתרונות לתוך צלוחיות. דגירה התאים במשך 30 דקות ב 5% CO ₂ ב 37 ° C. במהלך זה ריאגנטים הדגירה first לעבור בחופשיות דרך קרום התא, אבל פעם בתוך התא, ריאגנטים הופכים תאים impermeant תוצרי התגובה ניאון.
5. לאחר דגירה ראשונה, לשטוף דגירה תאים בינוניים עם תרבות לעוד שעתיים 5% CO ₂ ב 37 ° C.
6. Trypsinize תאים צלוחיות שניהם (עמוסה CMFDA ו CMRA) ומערבבים תאים אדום וירוק יחד יחס 01:01 בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל (TPP, ZDA). התאם את הריכוז התא 5 x 10 ⁶ תאים / מ"ל ידי דילול עם המדיום DMEM או על ידי ריכוז עם צנטריפוגות. מניחים ירידה של 20 μl ההשעיה תא היטב כל אחד 24 multiwell צלחת (TPP, ZDA). דגירה תאים 5% CO ₂ על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי לאפשר להם מעט לצרף אל פני השטח של הבאר קשרים התא.

השנייה. Electrofusion

1. הכן חיץ isoosomolar פוספט אשלגן (10 mM KH2PO4, 10 mM K ₂ HPO _4, 1mm MgCl _2, סוכרוז 250 מ"מ) פוספט hypoosmolar חיץ אשלגן (10 mM KH2PO4, 10 mM K ₂ HPO _4, 1mm MgCl _2, סוכרוז 75 mM) .
2. מניחים את multiwell עם תאים על העמדה הבמה, המיקרוסקופ אלקטרודות בתחתית הבאר לחבר אותם מחולל את הדופק.
3. לשטוף את התאים מ"ל 1 של חיץ isoosomolar פוספט אשלגן. הוסף 350 μl של חיץ hypoosmolar פוספט אשלגן על מנת לגרום לנפיחות התא. המאגר אמור לכסות את האלקטרודות.
4. השאירו תאים חיץ hypoosmolar 2 דקות לפני החלת פולסים חשמליים. במהלך הזמן הזה זרם של מולקולות המים לתוך התאים בשל חוסר איזון אוסמוטי בין הפנים לבין החוץ של התאים לגרום לעלייה של נפח התא. פולסים חשמליים צריך להיות מיושם כאשר תאים קרובים כרכים המקסימלי שלהם, לפני תחילת הירידה בהיקף הרגולציה.
5. כדי להשיג electrofusion האופטימלי ולשמור על כדאיות התא, פרמטרים אופטימליים של פולסים חשמליים אמור לשמש. אלה תלויות שורת תאים המשמשים [1]. בניסוי זה רכבת של 8 פולסים מלבני (כל אחד עם משך 100 μs בבית הרץ 1) מוחל על כל דגימה באמצעות מכשיר electroporation (ב Cliniporator במקרה שלנו, איג'יאה, איטליה). פולסים מועברים לשני Pt / עיר אלקטרודות מקבילות חוט בקוטר 0.8 מ"מ ו - 5 מ"מ המרחק ביניהם, יצירת שדה חשמלי של כ 1200 V / ס"מ בין האלקטרודות בכל טוב, למעט לשלוט היטב.
6. השאר את התאים ללא הפרעה במשך 10 דקות לאחר הלידה הדופק. קבע את התשואה היתוך באמצעות מיקרוסקופ לעומת הניאון שלב.

ג. תמונה הרכישה קביעת התשואה היתוך

1. התאים הם נצפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (במקרה שלנו Zeiss AxioVert 200, Zeiss, גרמניה) מצויד אובייקטיבי (X20) ומצלמה מקורר CCD (VisiCam 1280, Visitron, גרמניה). התמונות הן רכשה MetaMorph 7.1.1 (התקנים מולקולריים, ארה"ב), אך רכישת תוכנה דומה אחרת יכול לשמש גם. CMFDA מתרגש עם monochromator (צבעוני IV, Visitron, גרמניה) ב 492 ננומטר CMRA ב 548 ננומטר. הקרינה של CMFDA ו CMRA נרכש באמצעות שני מסנני פליטה, אחד מרוכז ב 535 ננומטר (HQ535/30m, עבור CMFDA) ואת מרוכז אחרים 510 ננומטר (D605/55m, עבור CMRA, הן Chroma, ארה"ב). השימוש dichroic במראה (Q515LP) מנעו לדבר לעבור ערוץ.
2. רוכשת שלוש תמונות (לעומת שלב, אדום וירוק פלואורסצנטי) במשך חמישה שדות שנבחרו באקראי היטב כל אחד. יצירת ערוץ שלוש תמונות מתוך שלישיה כל התמונה. בתמונה כגון הציטופלסמה fluorescing ניתן לראות יחד עם קרום התא. התאים התמזגו ולכן יכול להיקבע בקלות [תמונה 1].
3. ספירת כל שלושת סוגי התאים (אדום, ירוק ניאון dually) בתוך תמונה תלת כל ערוץ. לקבוע את אחוז התאים פלורסנט dually על ידי חלוקת מספר התאים פלורסנט dually עם מספר תאים כל אחת מהתמונות. תשואה Fusion מוגדר כאחוז של תאים פלורסנט dually כפול 2 מאז מחצית התאים התמזגו לא מזוהים (כאשר תאים של הפתיל באותו צבע).

נציג תוצאות

איור 1 שלושה מיקרוסקופיה ערוץ תמונה של B16F1 תאים לאחר electrofusion:. בניגוד שלב, CMRA פלואורסצנטי (עירור ב 548 ננומטר) CMFDA פלואורסצנטי (עירור ב 492 ננומטר), הגדלה 20x אובייקטיבי

Discussion

היכולת של קרום התא אל הפתיל הלא ספציפית, למשל, על ידי שדות חשמליים חיצוניים, חשוב הרפואה והביוטכנולוגיה, מחקר בביולוגיה. היתוך ספציפי כזה מאפשר ייצור של תאים היברידית יקר מאוד את המוצרים שלהם, כגון נוגדנים חד שבטיים, מספק מידע על המנגנונים הבסיסיים של היתוך [2]. Electrofusion היא שיטה פוטנציאלי יעיל מאוד שכן הוא יכול להיות מותאם כראוי לסוגים שונים של תאים. Electrofusion מושגת כאשר תאים מגע פיזי קרוב מובאים למצב fusogenic שלהם (מועדים היתוך) באמצעות מתח גבוה פולסים חשמליים. את היעילות של electrofusion תלוי פרמטרים שונים המשפיעים על שני חלקים של תהליך electrofusion. חלק ראשון של תהליך electrofusion הוא הישג של מגע פיזי קרוב בין התאים, אשר ניתן להשיג עם שיטות שונות [3-8]. שיטה דבקות (תאים גוברת מפגש) יכול להיות מנוצל ביעילות בשל הקשר תא הוקמה באופן ספונטני באזורי גדול בין תאים, אך היא מייצרת תאים התמזגו גדול מאוד עם גרעינים רבים. אנו בשיטת דבקות שונה, שבו תאים קטנים (עם הגרעינים 2-5), אשר יש סיכוי גבוה יותר לשרוד להתרבות, מתקבלים (איור 1). קשר בין תאים גם ליהנות נפיחות האוסמוטי של תאים, עקב טיפול אוסמוטי השתמשו בניסוי [9]. החלק השני של התהליך electrofusion הוא הישג של מדינת fusogenic של קרום התא. המדינה Fusogenic וקושרת היטב עם המדינה electropermeabilized של הממברנה (תאים שאינם דווקא permeabilized מולקולות שבדרך כלל לא יכול לעבור דרך הממברנה ללא פגע), והוא נשלט על ידי הפרמטרים זהה של פולסים חשמליים (אמפליטודה, אורך מספר ותדירות) [10] . הערכים של הפרמטרים החשמליים הדרושים electroporation אופטימלי [1] electrofusion שונים בין תאים שונים, תלוי בגודל תאים התכונות הביולוגיות שלהם. פרמטרים חשמל וכך צריך להיות מותאם עבור שורות תאים שונים, אשר משמשים כשותפים היתוך, כדי להשיג היתוך.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMRA	Reagent	Invitrogen	C34551	Cytosolic fluorescent dye
CMFDA	Reagent	Invitrogen	C7025	Cytosolic fluorescent dye
DMSO	Reagent	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM	Reagent	Sigma-Aldrich	D5671	Dulbecco’s modified Eagle’s medium
Fetal calf serum	Reagent	Sigma-Aldrich	F4135
L-glutamine	Reagent	Sigma-Aldrich	G7513
crystacillin	Reagent	Pliva	625110	antibiotic
gentamicin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1397	antibiotic
Hepes	Reagent	Sigma-Aldrich	H0887
KH2PO4	Reagent	Merck & Co., Inc.	A124873 927
KH2PO4	Reagent	Sigma-Aldrich	4248
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich	M-8266
NaCl	Reagent	Fluka	71382
KCl	Reagent	Merck & Co., Inc.	A154336 908
MgSO4	Reagent	Sigma-Aldrich	M2643
D-glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Reagent	Sigma-Aldrich	C4901
sucrose	Reagent	Sigma-Aldrich	16104
Electric pulse generator	Tool	IGEA		Cliniporator VITAE
Multiwell plate	Tool	Techno Plastic Products	92424
50 ml centrifuge tube	Tool	Techno Plastic Products	91050
15 ml centrifuge tube	Tool	Techno Plastic Products	91015
25 cm2 culture flask	Tool	Techno Plastic Products	90026
Electrodes	Tool	Custom Made		Pt/Ir