Elettrosaldabili cellula visualizzate con microscopia a fluorescenza

Riepilogo

In questo video si dimostra efficiente elettrofusione di cellule In vitro Per mezzo di metodo rispetto modificati utilizzando elettroporazione e la rilevazione successiva visualizzazione fuso cellule con microscopia a fluorescenza.

Abstract

Elettrofusione di cellule è un metodo sicuro e non virale e non chimici che possono essere utilizzati per la preparazione di cellule ibride per la terapia umana. Elettrofusione consiste nell'applicazione di brevi impulsi elettrici ad alta tensione per le cellule che sono in stretto contatto. Applicazione di breve, ad alta tensione impulsi elettrici provoca destabilizzazione della membrana plasmatica delle cellule. Membrane destabilizzato sono più permeabili di diverse molecole e anche incline alla fusione con le membrane vicine destabilizzato. Elettrofusione è quindi un metodo conveniente per raggiungere un non-specifico fusione di cellule molto diverse

Protocollo

I. Caricamento delle celle con celle inseguitori CMFDA e CMRA

1. Gli esperimenti sono stati condotti su cellule precedentemente preparato delle linee cellulari di melanoma mouse (B16-F1). Le cellule sono coltivate in due separate 25 cm ² fiasche cultura (TPP, ZDA) al 70-80% confluenza nel terreno di coltura DMEM (Dulbecco modificato medio di Eagle) supplementato con 10% siero fetale bovino, 0,15 mg / ml L-glutamina, 16 mg / ml di gentamicina (tutti da Sigma-Aldrich, Germania), 200 unità / ml crystacillin (Pliva, Croazia), e incubate nel 5% CO ₂ a 37 ° C.
2. Preparare due soluzioni da 10 mM stock di inseguitori Cell (Invitrogen, USA) con l'aggiunta di 10,76 microlitri e 9 microlitri (per il verde CMFDA e per Orange CMRA, rispettivamente) di DMSO (Sigma-Aldrich, Germania) a 50 mg del colorante in originale Invitrogen flaconcino. La soluzione madre può essere conservato in frigorifero a 4 ° C per pochi mesi. Prima di iniziare gli esperimenti, riscaldare la soluzione fino a quando i cristalli di DMSO sciogliere.
3. Preparare bicarbonato senza Krebs-tampone HEPES (130 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1,2 mM MgSO _4, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 11,7 mm D-glucosio, 1,3 mM CaCl _2, 10 HEPES mM, pH 7,4). In due tubi da 15 ml Eppendorf separatamente mix 2,1 ml di ciascuna soluzione madre (10 mM CMFDA o CMRA, rispettivamente) in 3 ml di bicarbonato senza Krebs-tampone HEPES. Questo produce una "soluzione di carico" che contiene circa 7 mM CMFDA (o CMRA).
4. Lavare le cellule due volte con il bicarbonato senza Krebs-tampone HEPES e quindi inserire il caricamento soluzioni nelle beute. Incubare le cellule per 30 minuti in 5% CO ₂ a 37 ° C. Durante questo reagenti incubazione prima passare liberamente attraverso le membrane delle cellule, ma una volta all'interno della cellula, i reagenti si trasformano in cellule impermeant prodotti di reazione fluorescente.
5. Dopo la prima incubazione, lavare e incubare cellule con terreno di coltura per altre due ore in 5% CO ₂ a 37 ° C.
6. Trypsinize cellule in entrambi i flaconi (caricato con CMFDA e CMRA) e mescolare globuli rossi e verdi insieme in un rapporto di 1:1 in un tubo da centrifuga da 50 ml (TPP, ZDA). Regolare la concentrazione cellulare di 5 x 10 ⁶ cellule / ml per diluizione con mezzo di DMEM o mediante concentrazione con centrifuga. Inserire una goccia 20 ml di sospensione di cellule in ciascun pozzetto della piastra 24 pozzetti (TPP, ZDA). Incubare cellule nel 5% CO ₂ a 37 ° C per 20 minuti per consentire loro di attaccare un po 'alla superficie del pozzo e stabilire contatti cell.

II. Elettrofusione

1. Preparare isoosomolar tampone fosfato di potassio (10 mM KH2PO4, 10 mM K ₂ HPO _4, 1mM _MgCl2, 250 mM saccarosio) e hypoosmolar tampone fosfato di potassio (10 mM KH2PO4, 10 mM K ₂ HPO _4, 1mM _MgCl2, 75 mM saccarosio) .
2. Posizionare il pozzetti con le cellule al microscopio sul palco, la posizione degli elettrodi sul fondo del pozzo e collegarli al generatore di impulsi.
3. Lavare le cellule con 1 ml di isoosomolar tampone fosfato di potassio. Aggiungere 350 ml di hypoosmolar tampone fosfato di potassio al fine di indurre rigonfiamento delle cellule. Il buffer dovrebbe coprire gli elettrodi.
4. Lasciare le cellule nel buffer hypoosmolar per 2 minuti prima di applicare gli impulsi elettrici. Durante questo periodo afflusso di molecole d'acqua all'interno delle cellule a causa di squilibrio osmotico tra l'interno e l'esterno delle cellule causano un aumento del volume cellulare. Impulsi elettrici devono essere applicate quando le cellule sono vicini al loro volume massimo, prima di iniziare a regolamentare diminuire il volume.
5. Per raggiungere elettrofusione ottimale e mantenere la vitalità cellulare, i parametri ottimali di impulsi elettrici devono essere utilizzati. Questi dipendono da linee cellulari utilizzate [1]. In questo esperimento un treno di 8 impulsi rettangolari (ciascuno con durata di 100 ms a 1 Hz) viene applicato a ciascun campione, utilizzando un dispositivo elettroporazione (nel nostro caso Cliniporator, IGEA, Italia). Gli impulsi vengono consegnati a due parallele Pt / Ir elettrodi a filo da 0,8 mm di diametro e 5 mm di distanza tra loro, creando un campo elettrico di circa 1200 V / cm tra gli elettrodi in ogni bene, tranne per il controllo dei pozzi.
6. Lasciare le cellule indisturbato per 10 minuti dopo la consegna degli impulsi. Determinare il rendimento di fusione mediante microscopia a fluorescenza e contrasto di fase.

III. Acquisizione di immagini e la determinazione del rendimento fusione

1. Le cellule sono osservati utilizzando un microscopio a fluorescenza (nel nostro caso Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Germania) equipaggiato con un obiettivo (x20) ed una camera CCD raffreddata (VISICAM 1280, Visitron, Germania). Le immagini vengono acquisite in MetaMorph 7.1.1 (Molecular Devices, USA), ma altri software di acquisizione simili possono anche essere utilizzati. CMFDA è eccitato con un monocromatore (policroma IV, Visitron, Germania) a 492 nm e CMRA a 548 nm. La fluorescenza della CMFDA e CMRA viene eseguita utilizzando due filtri di emissione, uno centrato a 535 nm (HQ535/30m, per CMFDA) e l'altra centrata a 510 nm (D605/55m, per CMRA, sia Chroma, USA). L'uso di specchi dicroici (Q515LP) hanno impedito la cross talk canale.
2. Acquisire tre immagini (contrasto di fase, fluorescenza rossa e verde) per cinque campi scelti a caso in ciascun pozzetto. Creare tre immagini per ogni canale tripletta immagine. In tale immagine citoplasma fluorescenti possono essere visti insieme con le membrane cellulari. Cellule fuse può quindi essere facilmente determinato [Figura 1].
3. Contare tutti e tre i tipi di cellule (rosso, verde e fluorescente doppiamente) in ogni immagine a tre canali. Determinare la percentuale di cellule doppiamente fluorescenti dividendo il numero di cellule doppiamente fluorescenti con il numero di tutte le cellule in ogni immagine. Resa fusione è definita come la percentuale di cellule doppiamente fluorescenti moltiplicato per 2 in quanto la metà delle cellule fuse non vengono rilevati (quando le cellule del fusibile stesso colore).

Rappresentante Risultati

Figura 1 Tre immagine microscopia canale di B16F1 cellule dopo elettrofusione:. Contrasto di fase, CMRA fluorescenza (eccitazione a 548 nm) e CMFDA fluorescenza (eccitazione a 492 nm), ingrandimento obiettivo 20x

Discussione

La capacità delle membrane cellulari di fondere in modo non specifico, ad esempio, da campi elettrici esterni, è importante per la biotecnologia, la medicina e la ricerca in biologia. Tale fusione non specifico permette la produzione di cellule ibride di grande valore e dei loro prodotti, come gli anticorpi monoclonali, e fornisce informazioni sui meccanismi fondamentali di fusione [2]. Elettrofusione è un metodo potenzialmente molto efficace in quanto può essere regolata correttamente a diversi tipi di cellule. Elettrofusione si ottiene quando le cellule in stretto contatto fisico sono messi a loro stato fusogenic (soggetto ad fusione) per mezzo di impulsi elettrici ad alta tensione. L'efficienza di elettrofusione dipende da vari parametri che influiscono sulle due parti del processo di elettrofusione. La prima parte del processo di elettrofusione è il raggiungimento del contatto fisico tra le cellule, che possono essere ottenuti con metodi diversi [3-8]. Metodo di aderenza (cellule in crescita a confluenza) possono essere utilizzate in modo efficiente a causa di contatti cellule spontaneamente stabilimenti situati in zone di grandi dimensioni tra le cellule, tuttavia, che produce le cellule fuse molto grande con molti nuclei. Stiamo usando il metodo di aderenza modificato, dove celle più piccole (da 2 a 5 nuclei), che hanno maggiori probabilità di sopravvivere e proliferare, sono ottenuti (Figura 1). Il contatto tra le cellule anche beneficiare di rigonfiamento osmotico delle cellule, a causa di un trattamento osmotico utilizzati per l'esperimento [9]. Seconda parte del processo di elettrofusione è il raggiungimento dello stato fusogenic delle membrane cellulari. Stato Fusogenic correla bene con lo stato electropermeabilized della membrana (cellule non sono specificamente permeabilizzate alle molecole che normalmente non può passare attraverso la membrana intatta) ed è regolato dagli stessi parametri degli impulsi elettrici (ampiezza, lunghezza, numero e frequenza) [10] . I valori dei parametri elettrici necessari per l'elettroporazione ottimale [1] e elettrofusione differiscono tra cellule diverse e dipendono dalle dimensioni delle cellule e le loro proprietà biologiche. Parametri elettrici devono quindi essere ottimizzati per diverse linee cellulari, che vengono utilizzati come partner di fusione, per ottenere la fusione.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMRA	Reagent	Invitrogen	C34551	Cytosolic fluorescent dye
CMFDA	Reagent	Invitrogen	C7025	Cytosolic fluorescent dye
DMSO	Reagent	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM	Reagent	Sigma-Aldrich	D5671	Dulbecco’s modified Eagle’s medium
Fetal calf serum	Reagent	Sigma-Aldrich	F4135
L-glutamine	Reagent	Sigma-Aldrich	G7513
crystacillin	Reagent	Pliva	625110	antibiotic
gentamicin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1397	antibiotic
Hepes	Reagent	Sigma-Aldrich	H0887
KH2PO4	Reagent	Merck & Co., Inc.	A124873 927
KH2PO4	Reagent	Sigma-Aldrich	4248
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich	M-8266
NaCl	Reagent	Fluka	71382
KCl	Reagent	Merck & Co., Inc.	A154336 908
MgSO4	Reagent	Sigma-Aldrich	M2643
D-glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Reagent	Sigma-Aldrich	C4901
sucrose	Reagent	Sigma-Aldrich	16104
Electric pulse generator	Tool	IGEA		Cliniporator VITAE
Multiwell plate	Tool	Techno Plastic Products	92424
50 ml centrifuge tube	Tool	Techno Plastic Products	91050
15 ml centrifuge tube	Tool	Techno Plastic Products	91015
25 cm2 culture flask	Tool	Techno Plastic Products	90026
Electrodes	Tool	Custom Made		Pt/Ir