Сотовые Электромуфтовая Визуализированные с флуоресцентной микроскопии

Резюме

В этом видео мы продемонстрирована высокая эффективность электромуфтовой клеток В пробирке С помощью модифицированного метода с помощью соблюдения электропорации и последующего обнаружения плавленого визуализации клеток с флуоресцентной микроскопии.

Аннотация

Сотовые электромуфтовой является безопасным, невирусных и нехимических методов, которые могут быть использованы для получения гибридных клеток для терапии человека. Электромуфтовая предполагает применение коротких высоковольтных электрических импульсов к клеткам, которые находятся в тесном контакте. Применение Короче говоря, высоковольтных импульсов электрических причин дестабилизации клеточных мембран плазмы. Дестабилизировали мембраны более проницаемыми для различных молекул, а также склонных к слиянию с любыми соседними дестабилизировали мембран. Электромуфтовая, таким образом, удобный способ для достижения неспецифические слияние очень разные клетки

протокол

I. Загрузка клеток с сотового трекеры CMFDA и CMRA

1. Эксперименты проводились на заранее подготовленные клетки меланомы мыши клеточной линии (B16-F1). Клетки, выращенные в двух отдельных 25 см ² колбах культуры (ТЭС, ZDA) до 70-80% слияния в культуральной среде DMEM (среда Дульбекко изменение Орла) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,15 мг / мл L-глутамина, 16 мг / мл гентамицина (все от Sigma-Aldrich, Германия), 200 ед / мл crystacillin (Плива, Хорватия), и инкубировали в 5% CO ₂ при температуре 37 ° C.
2. Приготовьте два 10 мМ растворы клеточных трекеры (Invitrogen, США), добавляя 10,76 мкл и 9 мкл (для зеленого CMFDA и оранжевой CMRA, соответственно) ДМСО (Sigma-Aldrich, Германия) до 50 мкг красителя в исходном Invitrogen флаконе. Маточный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 4 ° С в течение нескольких месяцев. Перед началом экспериментов, разогреть решение пока кристаллы ДМСО растворяются.
3. Подготовка бикарбоната без Кребса Hepes буфера (130 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,2 мМ MgSO _4, 1,2 мМ KH ₂ PO _4, 11,7 мМ D-глюкозы, 1,3 мМ CaCl _2, 10 мМ HEPES, рН 7,4). В двух 15 мл Eppendorf труб отдельно смеси 2,1 мкл каждого стандартного раствора (10 мМ CMFDA или CMRA, соответственно) в 3 мл бикарбоната без Кребса Hepes буфера. Это дает "загрузки решение", содержащий около 7 мкМ CMFDA (или CMRA).
4. Промойте клетки в два раза с бикарбонатом без Кребса Hepes буфер, а затем вставить загрузку решений в колбах. Инкубируйте клетки в течение 30 минут в 5% CO ₂ при температуре 37 ° C. Во время этой первой инкубации реагентов свободно проходить через клеточные мембраны, но как только внутри клетки, реагенты превращаются в клеточной impermeant флуоресцентных продуктов реакции.
5. После первой инкубации, промыть и инкубировать клетки с питательной среде в течение еще ​​двух часов в 5% CO ₂ при температуре 37 ° C.
6. Trypsinize клетки в обоих колбах (загружается с CMFDA и CMRA) и смешать красный и зеленый клетки вместе в соотношении 1:1 в 50 мл центрифужную пробирку (ТЭС, ZDA). Отрегулируйте концентрацию клеток до 5 х 10 ⁶ клеток / мл путем разбавления среды DMEM или концентрации с центрифугой. Место 20 мкл каплю суспензии клеток в каждой лунке от 24 многоямного пластины (ТЭС, ZDA). Инкубируйте клеток в 5% CO ₂ при 37 ° С в течение 20 минут, чтобы позволить им немного приложить к поверхности хорошо и установить контакты клетка.

II. Электромуфтовая

1. Подготовка isoosomolar фосфатного буфера калия (10 мМ КН2РО4, 10 мМ K ₂ HPO _4, 1 мМ MgCl _2, 250 мМ сахарозы) и hypoosmolar калий фосфатного буфера (10 мМ КН2РО4, 10 мМ K ₂ HPO _4, 1 мМ MgCl _2, 75 мМ сахарозы) .
2. Место многоямного с ячейками на столике микроскопа, положение электродов на дно колодца и соединить их с генератора импульсов.
3. Вымойте клеток с 1 мл isoosomolar калий фосфатного буфера. Добавить 350 мкл hypoosmolar калий фосфатного буфера, чтобы вызвать отек ячейки. Буфер должен покрывать электроды.
4. Оставьте клеток в hypoosmolar буфера в течение 2 минут перед нанесением электрических импульсов. За это время приток молекул воды в клетки из-за осмотического дисбаланса между внутренней и внешней стороне клетки причиной увеличения объема клеток. Электрические импульсы должны применяться, когда клетки близки к максимальным объемам, прежде чем начать нормативно уменьшения громкости.
5. Для достижения оптимального электромуфтовой и поддерживать жизнеспособность клеток, оптимальных параметров электрических импульсов должен быть использован. Они зависят от клеточной линии использовались [1]. В этом эксперименте поезд из 8 прямоугольных импульсов (каждый продолжительностью 100 мкс с частотой 1 Гц) применяется к каждому образцу, используя электропорации устройства (в нашем случае Cliniporator, IGEA, Италия). Импульсы поступают в двух параллельных Pt / Ir электродов проволоки с диаметром 0,8 мм и 5 мм расстояние между ними, создавая электрическое поле около 1200 В / см между электродами в каждой лунке, за исключением контрольный колодец.
6. Оставьте клетки в покое на 10 минут после импульса доставки. Определить слияние выход с помощью флуоресцентной и фазового контраста микроскопии.

III. Приобретение изображения и определение слияния выход

1. Клетки, наблюдаемые с помощью флуоресцентного микроскопа (в нашем случае Zeiss Axiovert 200, Zeiss, Германия), оснащенных цели (x20) и охлаждением ПЗС-камеры (VisiCam 1280, Visitron, Германия). Изображения, приобретенные в Метаморф 7.1.1 (Molecular Devices, США), но и других подобных программ приобретения также могут быть использованы. CMFDA волнует монохроматора (полихромные IV, Visitron, Германия) при 492 нм и CMRA на 548 нм. Флуоресценции CMFDA и CMRA приобретается с помощью двух выбросов фильтрами, один с центром в нм 535 (HQ535/30m, для CMFDA), а другая с центром в точке 510 нм (D605/55m, для СMRA, как Chroma, США). Использование дихроичных зеркала (Q515LP) помешали говорить канал крест.
2. Приобретать три изображения (фазового контраста, красного и зеленого свечения) в течение пяти случайно выбранных полей в каждую лунку. Создать три изображения канала от каждого изображения триплет. В таких изображений флуоресцирующих цитоплазму можно увидеть вместе с клеточных мембран. Плавленый клетки Таким образом, можно легко определить [Рисунок 1].
3. Подсчет всех трех типов клеток (красный, зеленый и двойственно флуоресцентные) в каждом три канала изображения. Определить процент дуально флуоресцентные клетки путем деления числа дуально флуоресцентных клеток с числом всех клеток в каждом изображении. Fusion доходность определяется как процент дуально флуоресцентные клетки умножаются на 2, так как половина плавленого клеток не обнаружено (когда клетки одного и того же предохранитель цвета).

Представитель Результаты

Рисунок 1 Три канала микроскопии образ B16F1 клеток после электромуфтовой. Фазового контраста, CMRA флуоресценции (возбуждение при 548 нм) и CMFDA флуоресценции (возбуждение при 492 нм), цель увеличение 20x

Обсуждение

Способность клеточных мембран к предохранитель неспецифически, например, с помощью внешнего электрического поля, имеет большое значение для биотехнологий, медицины и научных исследований в биологии. Такие неспецифические слияние позволяет получать весьма ценные гибридные клетки и их продукты, такие как моноклональные антитела, и предоставляет информацию о фундаментальных механизмов синтеза [2]. Электромуфтовая является потенциально очень эффективный метод, так как это может быть правильно отрегулирован для различных типов клеток. Электромуфтовая достигается тогда, когда клетки в тесном физическом контакте были приведены в их fusogenic состоянии (склонные к слиянию) с помощью высоковольтных электрических импульсов. Эффективность электромуфтовой зависит от различных параметров, которые влияют на две части электромуфтовой процесса. Первая часть электромуфтовой процесса является достижение близкий физический контакт между клетками, которые могут быть получены различными методами [3-8]. Соблюдение метод (растущих клеток до слияния) могут быть эффективно использованы из-за спонтанно создана ячейка контактов в крупных зонах между клетками, однако, он производит очень большое плавленого клетки с многочисленными ядрами. Мы с помощью модифицированного метода приверженности, где мелкие клетки (с 2 до 5 ядер), которые имеют больше шансов выжить и размножаться, получены (рис. 1). Контакт между клетками также извлечь выгоду из осмотическое набухание клеток, из-за осмотического лечение, используемое в эксперименте [9]. Вторая часть электромуфтовой процесс достижения fusogenic состояние клеточных мембран. Fusogenic состоянии хорошо коррелирует с electropermeabilized состояние мембраны (клетки неспецифически проницаемыми для молекул, которые обычно не могут пройти через неповрежденную мембрану) и управляется одними и теми же параметрами электрических импульсов (амплитуда, длина, количество и частота) [10] . Значения электрических параметров, необходимых для оптимального электропорации [1] и электромуфтовой отличаются между различными клетками и зависят от размера ячеек и их биологические свойства. Электрические параметры таким образом, должны быть оптимизированы для различных клеточных линий, которые используются как слияние партнеров, для получения синтез.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CMRA	Reagent	Invitrogen	C34551	Cytosolic fluorescent dye
CMFDA	Reagent	Invitrogen	C7025	Cytosolic fluorescent dye
DMSO	Reagent	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM	Reagent	Sigma-Aldrich	D5671	Dulbecco’s modified Eagle’s medium
Fetal calf serum	Reagent	Sigma-Aldrich	F4135
L-glutamine	Reagent	Sigma-Aldrich	G7513
crystacillin	Reagent	Pliva	625110	antibiotic
gentamicin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1397	antibiotic
Hepes	Reagent	Sigma-Aldrich	H0887
KH2PO4	Reagent	Merck & Co., Inc.	A124873 927
KH2PO4	Reagent	Sigma-Aldrich	4248
MgCl2	Reagent	Sigma-Aldrich	M-8266
NaCl	Reagent	Fluka	71382
KCl	Reagent	Merck & Co., Inc.	A154336 908
MgSO4	Reagent	Sigma-Aldrich	M2643
D-glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Reagent	Sigma-Aldrich	C4901
sucrose	Reagent	Sigma-Aldrich	16104
Electric pulse generator	Tool	IGEA		Cliniporator VITAE
Multiwell plate	Tool	Techno Plastic Products	92424
50 ml centrifuge tube	Tool	Techno Plastic Products	91050
15 ml centrifuge tube	Tool	Techno Plastic Products	91015
25 cm2 culture flask	Tool	Techno Plastic Products	90026
Electrodes	Tool	Custom Made		Pt/Ir