הכרומטין immunoprecipitation (שבב) לשינוי Assay דינמי היסטון בביטוי הגנים המופעלת בתא האדם

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד הכרומטין immunoprecipitation (שבב) משמש ללימוד שינויים דינאמיים לתבנית הכרומטין המווסתים את שעתוק המושרה על ידי במסלול הולכת אותות.

Abstract

בתגובה במגוון ligands תאית, STAT (מתמר אותות activator של שעתוק) גורמי תעתוק מגויסים במהירות ממצב רדום בציטופלסמה שלהם על פני הקולטנים בתא שבו הם מופעלים על ידי זרחון על שיירי טירוזין יחיד ^1. לאחר מכן הם dimerize ו translocate לגרעין לכונן שעתוק של גני מטרה, להשפיע, צמיחה בידול, הומאוסטזיס ואת התגובה החיסונית. באופן לא מפתיע, בהתחשב מעורבות נרחבת שלהם תהליכים בתא נורמלי, dysregulation של הפונקציה STAT תורם למחלות האדם, במיוחד סרטן מחלות אוטואימוניות ² ו ^3.

היא מבוססת היטב כי שעתוק מווסתת על ידי שינויים לתבנית הכרומטין ^4,5. שינויים אלה כוללים את הפעילות של ה-ATP תלוי קומפלקסים, כמו גם השינויים היסטון קוולנטיים ו מתילציה בדנ"א ^6. בגלל הפעלת STAT של ביטוי גנים הוא גם מהיר חולף, זה דורש מנגנונים ספציפיים עבור התבנית ויסות הכרומטין ב STAT תלויי לוקוסים גן. כדי להגדיר מנגנונים אלה, אנו לאפיין את השינויים היסטון והפעילות האנזימטית שיוצרים אותם לוקוסים גן להגיב איתות STAT. פרוטוקול זה מתאר הכרומטין immunoprecipitation, שיטה כי הוא בעל ערך לחקר STAT איתות הכרומטין ביטוי גנים מופעלים.

Protocol

תכנון

יום לפני ניסוי השבב המתוכנן, התאים צריכים להיות מתורבת, כך מספר מספיק זמין. נניח כי כל CHIP assay ידרוש ~ 1-1.5 ⁷ x 10 תאים. תמיד מתכנן לעשות הן שליליות (IgG) חיובי (נוגדן היסטון מחבת) בקרות ניסויים כפולים.
עצה - עבור תאים 2FTGH, כל CHIP assay דורש על אחד 15 ס"מ צלחת רקמה תרבות ב 80% confluency.

חלק 1: הכנת הכרומטין ולבצע CHIP

1. הסר מדיה התרבות לגרום לתאים של פעמים נדרש עם 20 מ"ל של 10% קוסמי עגל בסרום (CCS) / DMEM המכיל IFN-gamma ב 5 ng / mL. החלף את המדיה על צלחות uninduced עם 20 מ"ל של 10% CCS / DMEM גם כן.
2. במנדף קטר, להוסיף 540 פורמלדהיד 37% μL כדי 20 מ"ל של התקשורת (הריכוז הסופי 1%) בצלחת 15 ס"מ.
   עצה - צלחת הטיה להוסיף את פורמלדהיד לבריכה מדיה - אז הצלחת רוק להפיץ אותו באופן שווה.
3. אפשר crosslinking להמשיך במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הוסף גליצין ריכוז M 0.125 הסופי להפסיק crosslinking.
5. לשאוב אבק התקשורת לשטוף תאים פעם עם פוספט 10 מ"ל קרח קר בופר סליין (PBS).
6. איסוף תאים עם מגרד תא ~ 7 מ"ל PBS ולשלב תאים (מתוך 6 לוחות), אשר טופלו זהים שפופרת 50 מ"ל חרוטי על הקרח.
7. צנטריפוגה (Beckman Coutler אלגרה 12-R צנטריפוגה) בסל"ד 1800 על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לשאוב PBS.
   עצה - הצמד להקפיא את התא גלולה אם לעצור פה חנות ב -80 ° C.
8. Resuspend התא גלולה ב הצפת 4 מ"ל נפיחות (25 mM HEPES pH 7.8, 1.5 מ"מ MgCl _2, 10 mM KCl, 0.1% NP40. DTT הוסף 1 מ"מ, מעכבי פרוטאז השלם ומקררים על קרח לפני השימוש) והעברת 15 מ"ל חרוטי צינור.
   עצה - זה נפח המאגר נפיחות מתאים 6 צלחת איגום (~ 6-9 x 10 ⁷ תאים). חיץ פחות או יותר יכול לשנות את יעילות douncing.
9. לדגור על השעיית התא על קרח במשך 10 דקות.
10. העברת השעיה ל טרום מקורר 15 מ"ל douncer (ויטון) ו dounce 20 משיכות עם העלי א
11. העברת dounced תאים חזרה צינור חרוטי 15 מ"ל על הקרח.
12. צנטריפוגה בסל"ד 2500 למשך 5 דקות ב 4 ° C ו להתעלמות supernatant.
13. Resuspend גלולה גרעיני (~ 200 μL מ 6 צלחות) ב 3 מ"ל (15 כרכים גלולה) של הצפת Sonication (50 mM HEPES pH 7.9, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, deoxycholate נתרן 0.1%, 0.1% SDS. הוסף מעכבי פרוטאז השלם ומקררים על קרח רק לפני השימוש).
    עצה - זה נפח המאגר sonication מתאים 6 צלחת איגום (~ 6-9 x 10 ⁷ תאים). חיץ פחות או יותר יכול לשנות את יעילות sonication.
14. Sonicate ההשעיה גרעינים על קרח במשך 10 מחזורים (20 שניות on/40 שניות את / משרעת ההגדרה של 8) באמצעות Sonicator Misonix 3000 מצויד microtip. זה בדרך כלל התוצאות שברי הכרומטין בממוצע 200-1000 bps בגודל.
    טיפ - מכיוון sonicators ישתנו, את היעילות sonication צריכה להיקבע באופן אמפירי. כדי לעשות זאת, לקחת aliquots של μL 20 sonication לפני ואחרי כל מחזור sonication. מחממים אלה דגימות 65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות. הוסף חוצץ טעינת ה-DNA ולהפעיל תקן 1% agarose / TBE ג'ל לדמיין שברי DNA).
    
15. העברת sonicated חומר צינור SS34 צנטריפוגה צנטריפוגה ו 20 דקות ב 4 ° C בסל"ד 13000 ב הרוטור SS34 (Sorvall RC6 פלוס צנטריפוגה) כדי גלולה מה הוא בדרך כלל כמות קטנה של פסולת התא.
16. בזהירות כדי להעביר את supernatant צינור חרוטי 15 מ"ל על הקרח.
17. מראש ברור ידי הוספת הזרע 360 μL סלמון DNA / או חלבון G slurry agarose חרוזים נדנדה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות.
    עצה - צעד זה מקטין את הרעש assay העולה מן הלא ספציפית אירועים מחייב.
18. צנטריפוגה בסל"ד 1000 על 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות גלולה חרוזים agarose.
19. העברת מראש פינה supernatant אל צינור אחר חרוטי 15 מ"ל על הקרח.
20. מדוד את A260 יחידות של הכרומטין מראש פינה את ולהתאים את עוצמת הקול עם הצפת Sonication עד ארבע (4) A260 יחידות (0.2 מ"ג / מ"ל ​​בהנחה A260 1 יחידה = 0.050 מ"ג / מ"ל)
    עצה - כדי למדוד את A260 יחידות, לדלל 10 μL של הכרומטין מראש פינה ב 190 DDW μL; ספקטרופוטומטר ריק עם חיץ 10 sonication μL ב DDW μL 190.
    
21. שמור 75 μL של הכרומטין (ב A260 4 יחידות), כמו לדוגמא קלט ולאחסן ב 20 ° C עד מוכן להפוך crosslinks.
    עצה - שלב זה הוא קריטי לניתוח נתונים. אל תשכחי לקחת את aliquot קלט.
    
22. Aliquot הכרומטין מוכנים 1.7 צינורות microfuge מ"ל על ice כמו aliquots 1 מ"ל.
    עצה - אם לעצור כאן, הצמד להקפיא את הכרומטין מוכן על קרח יבש חנות ב -80 ° C. נ.ב.: הכרומטין מאוחסנים יכול להשפיל, ייצור פחות תוצאות אופטימליות, כך להימנע במידת האפשר.
    
23. מוסיפים את שבב כיתה נוגדנים דגימות המושרה ואת uninduced סטים כפולים. הוסף IgG (2 מיקרוגרם) והפאן היסטון H3 נוגדן (15 μL) כמו שולט שלילי וחיובי על קבוצות דגימות המושרה ואת uninduced.
    עצה - כמות הנוגדנים להשתמש צריכה להיקבע באופן אמפירי או לראות גיליון מוצר של הספק בסכומים שהציע. בדרך כלל 1-2 מיקרוגרם של הנוגדן שבב ציון עובד היטב. הכרך המתאים צריכה להיקבע באופן אמפירי עבור נוגדנים מסופקים כמו בסרום.
    
24. רוק כל צינורות לילה בשעה 4 ° C.

חלק 2: אוספים IMMUNOCOMPLEXES

1. הוסף 60 μL של זרע סלמון דנ"א / חלבון או חלבון G slurry חרוזים agarose לכל הצינורות.
   השתמש חלבון עצה עבור נוגדנים polyclonal ארנב חלבון G עבור נוגדנים חד שבטיים העכבר.
2. רוק בבית 4 ° C למשך לפחות 60 דקות.
3. גלולה immunocomplexes (חרוזים agarose) על ידי microfuging בעדינות בסל"ד 2000 על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
4. לשאוב supernatant.
5. שטפו את immunocomplexes עם 1 מ"ל של כל אחד Buffers לשטוף הבאים במשך 10 דקות עם נדנדה ב 4 ° C. Microfuge 3 דקות בסל"ד 2000 ב 4 ° C בין לשטוף כל לשאוב supernatant. שמור דגימות מקורר על הקרח. הוסף PMSF רק לפני השימוש.
   • מלח לשטוף נמוכה - 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 מ"מ טריס-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF
   • מלח לשטוף גבוהה - 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 מ"מ טריס-Cl, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM PMSF
   • LiCl שטפי - 0.25 מ LiCl, 1% NP-40, deoxycholate סודיום 1%, 1 mM EDTA, 10 mM טריס-Cl, pH 8.0, 1 mM PMSF
   • TE שטפי - שני רוחצת עם TE הצפת -10 mM טריס-Cl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF
6. הסר את הצפת לשטוף הסופי TE ואל חרוזים, להוסיף 500 הצפת elution μL (50 mM טריס-Cl, pH 8.0, 10 mM EDTA, SDS 1%).
   עצה - הצפת elution צריך להיות מוכן טרי.
   
7. וורטקס לערבב חרוזים agarose ב הצפת elution וחום במשך 30 דקות על 65 ° C.
   עצה - מערבולת כל צינור לפחות כל 10 דקות במהלך זה 30 דקות.
8. Microfuge למשך 30 שניות ב 2000 סל"ד ולהעביר את eluent לצינור microfuge חדש.
   טיפ - במהלך elution, להפשיר דוגמאות קלט ולהוסיף 500 הצפת elution μL לכל אחד. כלול דגימות אלה בכל הצעדים הולך קדימה.
   
9. הוסף 5 M NaCl לריכוז סופי של 200 מ"מ לכל דגימות מערבולת.
10. לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך הלילה (או לפחות 4 שעות).

חלק 3: ChIP'd לטהר DNA INPUT

1. Microfuge כל הדגימות למשך 30 שניות כדי לאסוף עיבוי על העפעפיים.
2. הוסף 1μL של RNAse (10 U / μL) אל צינור כל דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
3. הוסף 10 μL 0.5 M EDTA, 40 μL 0.5 M-Cl טריס pH 6.5, 2 μL proteinase K (10 מ"ג / מ"ל) ו לדגור על 45 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. עצה הכינו תערובת אמן ריאגנטים אלה ולהוסיף 52 μL על צינור אחד.
4. פנול / כלורופורם / isoamyl לחלץ אלכוהול ולאחר מכן כלורופורם / isoamyl אלכוהול לחלץ את הדגימות.
5. הוסף 2 הגליקוגן μL (25 מיקרוגרם / μL) ו 0.1 כרכים של pH Na Acetate 3M 5.2 ו מערבולת.
6. הוסף 2.5 כרכים של 100% אתנול ו מערבולת.
7. לדגור על 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

חלק 4: ChIP'd לטהר DNA INPUT המשך

1. דגימות Microfuge עבור מינימום של 20 דקות 13,000 סל"ד ב 4 ° C כדי להאיץ את ה-DNA / גליקוגן כדורי.
2. לשטוף עם DNA / גליקוגן כדורי עם 1 מ"ל של אתנול 70%.
3. האוויר יבש או יבש את כדורי במהירות בצנטריפוגה DNA סאוואנט ואקום מהירות.
   עצה - אל על יבש את ה-DNA.
4. Resuspend DNA / גליקוגן כדוריות בתוך מאגר TE 200 μL.
5. DNA (1 μL) מוכן כימות באמצעות PCR בזמן אמת. חנות ה-DNA שנותרו ב 20 ° C.
   עצה - שימוש יותר מ 1 μL של DNA יכולים לעכב את התגובות בזמן אמת PCR, כך הסולם בזהירות.

חלק 5: תוצאות נציג:

שבב קלט דגימות DNA הם לכמת עם Real-Time PCR ^7,8 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR המערכת) באמצעות פריימרים ספציפיים מוקד הגן של עניין. Primers כי היעד רצף גנומי ידוע להיות מועשר או חסר את השינויים היסטון להיות assayed יכול לשמש בקרות חיוביות ושליליות גם כן. נתונים מוצג כאחוז קלט. ההליך CHIP צריך להיות לגמרי repeated עם שלושה ביולוגיים משכפל כדי להבטיח שינויים דווח שינויים היסטון הם משמעותיים מבחינה סטטיסטית.

ישנם נושאים חשובים שיש להביא בחשבון בעת ​​שימוש בזמן אמת PCR לכמת DNA, כולל עיצוב פריימר, יעילות ה-PCR, ואת הדרך המתאימה כדי לחשב את אחוז נהלים קלט ונורמליזציה. כאשר פרופיל התפוסה שינוי היסטון ברחבי הגן, את יעילות ה-PCR חייב להיות עקבי בין כל זוגות פריימר. יצרן בזמן אמת, מערכת ה-PCR יכולה לספק את המידע האימונים הדרושים.

איור 1 מציג תוצאות נציג של הכרומטין immunoprecipitated במהלך ההפעלה של הגן STAT1 IRF1 ^9, מופעלות על ידי IFN-γ.

באיור 1. תפוסה של STAT1, RNA פולימראז II ו H3K36me3 היא דינמית במהלך ההפעלה של הגן STAT1 IRF1. (A, B, C) ​​שבב עם α-H3K36me3, α-STAT1 ו α-Pol II של הכרומטין שנאספו תאים 2FTGH המושרה עם IFN-γ במשך 30 דקות (ריבועים אדומים), 1.5 שעות (עיגולים כחולים), 5 שעות ( משולשים ירוקים) או uninduced (יהלומים שחורים). IgG הוא שליטה שלילי (אפור חוצה). (ד) פאן H3 הוא שליטה חיובית ומראה את התפוסה היסטון מול מוקד ב (עיגולים כחולים) המושרה ותנאי uninduced (יהלומים שחורים). לטבול סביב נ"ב -5 בשל דלדול הנוקלאוזום שנמצא באתרים להתחיל שעתוק.

Discussion

פרוטוקול שבב התווה שימש בהצלחה במעבדה כדי assay יותר מעשרים שינויים היסטון אחרת. בנוסף, יש לנו מאופיין בשינויים התפוסה של גורמי שעתוק, היסטון, שינוי אנזימים, חלבונים המזהים שינויים היסטון ואת השנייה RNA פולימראז מכונות שעתוק, בכמה IFN-γ גנים המושרה. השתמשנו גם את ההליך כדי ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	BP531-500
Chloroform/Isoamyl alcohol	Acros Organics	AC32715-5000
Complete Mini Protease Inhibitors	Roche Group	1836153
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.04N
DMEM	Hyclone	SH30243
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500
Ethanol	Pharmco Products, Inc.	zp1110EP
Glycine	Roche Group	100149
Glycogen	Roche Group	901393
HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
IFN-gamma	R&D Systems	285-IF-100
IgG	Jackson ImmunoResearch	109-005-003
KCl	MP Biomedicals
LiCl	Sigma-Aldrich	L4408
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Sodium Acetate	Fisher Scientific	BP333-500
Deoxycholic Acid Sodium Salt	Fisher Scientific	BP349-100
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5
NP40	US Biological	N3500
Anti-Histone H3, CT, pan	EMD Millipore	07-690
Phenol/chloroform/isoamyl	Fisher Scientific	108-95-2
Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	7647-14-5
PMSF	EMD Millipore	50-230-0316
Proteinase K	5 PRIME	2500140
RNAse A	5 PRIME	2500130
Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose	EMD Millipore	16-157
Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse	EMD Millipore	16-201
SDS	Fisher Scientific	BP166-500
Tris-Cl	Sigma-Aldrich	T5941
Triton X-100	Acros Organics	327372500
Anti-K36me3	Abcam	ab9050
Anti-STAT1	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-345X
Anti-RNA Polymerase II	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-899