인간의 세포에서 활성 유전자 발현의 어세 동적 히스톤 수정을 염색질 Immunoprecipitation (칩)

요약

이 프로토콜은 염색질 immunoprecipitation (칩)가 신호 전달 경로에 의해 유도 전사 조절 염색질 템플릿 동적 변경을 연구하는 데 사용됩니다 방법을 설명합니다.

초록

세포외 리간드의 다양한 대응, STAT (전사의 신호 변환기 및 활성)이 전사 요소 빠르게들은 하나의 티로신 잔기 ¹ 인산화에 의해 활성화됩니다 세포 표면 수용체에 세포질에서 숨겨진 상태에서 모집하고 있습니다. 그들은 다음 성장, 분화, 항상성 및 면역 반응에 영향을 미치는 대상 유전자의 전사를 드라이브에 핵을 dimerize 및 이동시키다. 되지 놀랍게도, 정상적인 세포 프로세스에서 광범위한 참여에 따라, STAT 기능의 dysregulation 특히 암 ² 면역 질환 ^3, 인간의 질병에 기여하고 있습니다.

그것은 잘 녹음이 ^4,5 염색질 템플릿 변경에 의해 규제되어 설정됩니다. 이러한 변경은 ATP에 의존 단지뿐만 아니라 공유 결합 히스톤 수정 및 DNA의 methylation ⁶ 활동을 포함합니다. 유전자 표현의 STAT 활성화가 신속하고 과도 모두이기 때문에, 그것은 STAT - 의존 유전자 loci modulating에서 염색질 템플릿에 대한 구체적인 메커니즘이 필요합니다. 이러한 메커니즘을 정의하려면, 우리는 히스톤 수정 및 STAT 신호에 응답 유전자 loci에서 그들을 생성하는 효소 활동을 특징. 이 프로토콜은 염색질 immunoprecipitation, STAT가 활성 유전자 발현의 염색질에 신호의 연구에 대한 가치있는 방법을 설명합니다.

프로토콜

계획

칩 실험이 계획되어 하루 전에, 세포가 충분한 숫자가 제공되도록 교양하여야한다. 각 칩 분석이 ~ 1-1.5 X 10 ⁷ 세포가 필요합니다 있다고 가정합니다. 항상 부정적인 (IgG)와 긍정적인 (팬 히스톤 항체) 컨트롤과 중복 실험을 모두 할 계획입니다.
팁 - 2FTGH 전지, 각 칩 분석이 80 % confluency 15 약 cm 조직 문화 요리가 필요합니다.

1 부 : 염색질 준비와 칩을 수행

1. 문화 미디어를 제거와 10 %의 우주 송아지 혈청 (CCS) / 5 NG / ML에서 IFN - 감마를 포함한 DMEM 20 ML로 필요한 시간에 대한 세포를 유도. CCS / DMEM뿐만 아니라 10 % 20 ML과 uninduced 접시에있는 미디어를 교체합니다.
2. 퓸 배출 후드에서는 15cm의 접시 미디어 20 ML (1 % 최종 농도)을 540 μL 37 % 포름 알데히드를 추가합니다.
   팁 - 틸트 판과 미디어 수영장에 포름 알데히드를 추가 - 다음 바위 플레이트는 균일하게 그것을 확산합니다.
3. 실온에서 10 분 진행 crosslinking을 허용합니다.
4. crosslinking를 중지 0.125 M 최종 농도 글리신을 추가합니다.
5. 미디어를 대기음 진공 10 ML 얼음 추위 인산염과 함께 한 세포 세차 호수 (PBS)를 버퍼.
6. ~ 7 ML PBS에 세포 스크레이퍼와 세포를 수집하고 얼음 50 ML 원뿔 관에 동일하게 취급했다 세포를 (6 판에서) 결합.
7. 4 1,800 rpm으로 원심 분리기 (베크맨 Coutler 알레 그라 12 - R 원심 분리기) · 5 분 C와 PBS를 대기음.
   팁 - 스냅 동결 세포 펠릿 경우 여기를 중지하고 -80 ° C.에 저장
8. 4 ML 부풀어 올랐고 버퍼 (25 MM의 HEPES 산도 7.8, 1.5 MM MgCl _2, 10 MM KCl, 0.1 % NP40. 1 ㎜의 DTT, 완전한 프로 테아제 억제제 및 사용하기 전에 얼음에 진정을 추가)의 세포 펠렛을 Resuspend과 15 전송 ML 원뿔 관.
   팁 -이 붓기 버퍼 볼륨 6 접시 풀링 (~ 6-9 X 10 ⁷ 세포)에 적합합니다. 더 많거나 적은 버퍼 douncing 효율성을 변경할 수 있습니다.
9. 10 분 얼음에 세포 현탁액을 품어.
10. 미리 차게 15 ML douncer (위턴)에 정지를 전송하고 유봉 A. 20 스트로크를 다운스
11. 전송 얼음에 15 ML 원뿔 관에 다시 세포를 dounced.
12. 4 5 분 2,500 rpm으로 원심 분리기는 ° C와 뜨는 폐기하십시오.
13. Sonication 버퍼 3 ML의 핵 펠릿 (6 접시에서 ~ 200 μL) (15 펠릿 볼륨) (50 MM의 HEPES의 산도 7.9, 140 MM NaCl, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X - 100, 0.1 %의 나트륨 deoxycholate, Resuspend 0.1 % SDS). 사용하기 직전 얼음 완료 테아제 억제제와 진정을 추가합니다.
    팁 -이 sonication 버퍼 볼륨 6 접시 풀링 (~ 6-9 X 10 ⁷ 세포)에 적합합니다. 더 많거나 적은 버퍼 sonication 효율을 변경할 수 있습니다.
14. microtip 장착된 Misonix의 Sonicator 3000을 사용하여 10 사이클 (20초 8 설정 on/40 초 ON / OFF 진폭)에 얼음 핵 서스펜션을 Sonicate. 크기 200-1000 BPS 평균 염색질 조각이 일반적으로 발생합니다.
    팁 - sonicators이 달라집니다 때문에 sonication 효율이 경험적으로 결정되어야합니다. 이렇게하려면, sonication 전에 각 sonication 사이클 이후 20 μL의 aliquots 가져가라. 4 시간 동안 65 ° C에서이 샘플을 가열. DNA 로딩 버퍼를 추가하고 DNA 조각을 시각화하기위한 기준 1퍼센트 아가로 오스 / TBE 젤을 실행합니다.)
    
15. 전송 4 20 분 SS34 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 자료를 sonicated ° 일반적으로 세포 파편의 소량 무엇 SS34 로터의 13,000 RPM (Sorvall RC6 플러스 원심 분리기)에서 펠렛을 C.
16. 조심스럽게 얼음 15 ML 원뿔 관에 뜨는을 전송하기만하면됩니다.
17. 360 μL 연어 정자 DNA / 단백질 A 또는 G 아가로 오스 비즈 슬러리를 추가하고 적어도 30 분 동안 4 ° C에서 락을에서 미리 취소합니다.
    팁 -이 단계가 아닌 특정 바인딩 이벤트에서 발생 분석에서 소음을 감소시킵니다.
18. 펠렛 아가로 오스 비즈 5 분 동안 4 ° C에서 1,000 rpm으로 원심 분리기.
19. 얼음 다른 15 ML 원뿔 관에 뜨는 사전 허가 전송합니다.
20. 미리 지워 염색질의 A260 단위를 측정하고 4 A260 단위 (0.2 MG / ML 1 A260 단위 = 0.050 MG / ML 가정)에 Sonication 버퍼로 음량을 조절
    190 μL DDW 10 μL sonication 버퍼와 빈 분광 광도계, - 팁 A260 단위를 측정하려면, 190 μL DDW의 사전 허가 염색질 10 μL를 희석.
    
21. 20 입력 샘플 및 저장소로 염색질의 75 μL (4 A260 단위에서) 저장 ° C crosslinks을 뒤집을 준비까지.
    팁 -이 단계는 데이터 분석을 위해 매우 중요합니다. 입력 나누어지는을 위해 게을리하지 마십시오.
    
22. I에서 1.7 ML의 microfuge 튜브로 나누어지는가 준비 염색질CE 1 ML의 aliquots로.
    팁 - 여기 중지하는 경우, -80에 드라이 아이스와 저장소에 준비된 염색질을 동결 스냅 ° C. NB가 : 가능하면 저장된 염색질은 덜 최적의 결과를보다 생산 저하시킬 수 있으므로 피하십시오.
    
23. 유도와 uninduced 샘플에 칩 등급 항체를 추가하면 중복으로 설정합니다. 유도 및 uninduced 샘플 세트로 부정과 긍정적인 컨트롤로 IgG (2 μg)과 히스톤 H3 이동 항체 (15 μL)를 추가합니다.
    팁 - 사용하는 항체의 금액은 경험적으로 결정 또는 제안 금액에 대한 공급 업체의 제품 시트를 참조해야합니다. 칩 학년 항체의 일반적으로 1-2 μg 잘 작동합니다. 적절한 볼륨이 혈청으로 제공하는 항체에 대한 경험적으로 결정되어야합니다.
    
24. 4 박 모두 튜브를 록 ° C.

2 부 : IMMUNOCOMPLEXES를 수집

1. 모든 튜브에 연어 정자 DNA / 단백질 A 또는 단백질 G 아가로 오스 비즈 슬러리의 60 μL를 추가합니다.
   팁 사용 단백질 마우스 단클론 항체에 대한 토끼 polyclonal 항체 및 단백질 G위한.
2. 적어도 60 분 4 ° C에서 록.
3. 4 2,0​​00 rpm으로 부드럽게 microfuging하여 펠렛은 immunocomplexes (아가로 오스 비즈) · 3 분 C.
4. 뜨는을 대기음.
5. 4 ° C. 로킹 10 분 동안 다음 씻어 버퍼의 각 1 ML로 immunocomplexes 와시 4 2,0​​00 rpm으로 3 분 Microfuge · 각 씻고 뜨는을 대기음 사이에 C. 얼음에 냉장 샘플 보관하십시오. 사용하기 직전 PMSF를 추가합니다.
   • 낮은 소금 워시 - 0.1 % SDS, 1 % 트리톤 X - 100, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 150 MM NaCl, 1 MM PMSF
   • 고 염분 워시 - 0.1 % SDS, 1 % 트리톤 X - 100, 2 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 20 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 500 MM NaCl, 1 MM PMSF
   • LiCl 워시 - 0.25 M LiCl, 1 % NP - 40, 1 %의 나트륨 deoxycholate, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 1 ㎜ PMSF
   • TE 워시 - TE 버퍼 -10 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM PMSF 두 씻는다
6. 최종 TE 버퍼 세척을 제거하고 구슬을 500 μL 용출 버퍼 (50 MM 트리스 - CL, 산도 8.0, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % SDS)을 추가합니다.
   팁 - 용출 버퍼가 신선하게 준비한다.
   
7. 65 30 분 용출 버퍼와 더위에 아가로 오스 비즈를 섞어 소용돌이 ° C.
   팁 -이 삼십분 동안 각각의 튜브는 최소한 10 분 간격 와동.
8. 2,000 rpm으로 30 초 동안 Microfuge 새로운 microfuge 튜브에 eluent를 전송합니다.
   팁 - 용출하는 동안 귀하의 입력 샘플을 해동하고 각 500 μL 용출 버퍼를 추가합니다. 앞으로 모든 단계에서 이러한 샘플을 포함합니다.
   
9. 모든 샘플 및 와동 200 mm의 최종 농도 5 M NaCl을 추가합니다.
10. 65 품어 ° C 숙박 (또는 적어도 4 시간).

3 부 : 정화 ChIP'd 및 입력 DNA

1. 뚜껑에 결로를 수집하는 30 초 동안 모든 샘플을 Microfuge.
2. 15 분 동안 상온에서 각각의 튜브와 부화 RNAse의 1μL (10 U / μL) 추가합니다.
3. 10 μL 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 40 μL 0.5 M 트리스 - CL 산도 6.5, 2 μL Proteinase K (10 MG / ML) 추가 45에서 60 분 ° C 품어. 팁이 시약의 마스터 믹스를 준비하고 각 튜브 52 μL를 추가합니다.
4. 페놀 / 클로로포름 / isoamyl 알콜 추출하고 클로로포름 / isoamyl 알콜 농도는 샘플을 추출합니다.
5. 2 μL 글리코겐 (25 μg / μL)와 3M 나 아세테이트 산도 5.2과 0.1의 소용돌이 볼륨을 추가합니다.
6. 100 % 에탄올과 와동 2.5 볼륨을 추가합니다.
7. ° C 하루 20 알을 품다.

4 부 : 정화 ChIP'd 및 입력 DNA 계속해서

1. 4 13,000 rpm으로 20 분 최소 Microfuge 샘플 ° C DNA / 글리코겐 알약을 촉진합니다.
2. 70 % 에탄올 1 ML과 DNA / 글리코겐 알약과 함께 씻으십시오.
3. 에어 DNA 사반트 속도 진공 원심 분리기에 알약이나 신속하게 건조 건조.
   팁 - 이상의 DNA를 건조하지 마십시오.
4. 200 μL TE 버퍼의 DNA / 글리코겐 알약을 Resuspend.
5. DNA (1 μL)은 실시간 PCR을 통해 부량 준비가되었습니다. 20 스토어 남아있는 DNA ° C.
   팁 - DNA 이상의 1 μL를 사용하여이 실시간 PCR 반응을 억제 수 있으므로주의와 규모.

제 5 부 : 대리인 결과 :

칩 및 입력 DNA 샘플은 관심의 유전자 로커스 특정 primers를 사용하여 리얼 타임 PCR ^7,8 (Biosystems 7500 빠른 리얼 타임 PCR 시스템을 적용)과 계량 수 있습니다. 알려진 대상 게놈 시퀀스의 강화 또는 assayed되는 히스톤 수정이 부족하는 것을 Primers는 긍정적이고 부정적인 통제뿐만 아니라 사용할 수 있습니다. 데이터 입력의 비율로 제공됩니다. 칩 절차는 전적으로해야 R세 epeated 생물 학적는 히스톤 수정에 보고된 통계적으로 의미있는 변화된다 보장하기 위해 복제합니다.

뇌관 디자인, PCR 효율, 그리고 입력과 정상화 절차의 %를 계산하는 적절한 방법을 포함하여 DNA를 수치 실시간 PCR를 사용할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 문제가 있습니다. 유전자에 걸쳐 히스톤 수정 인을 프로 파일링 때, PCR 효율은 모든 프라이머 쌍 간의 일치해야합니다. 실시간 PCR 시스템 제조 업체가 필요한 정보와 교육을 제공할 수 있습니다.

그림 1은 염색질의 대표적인 결과는 IFN - γ에 의해 트리거, IRF1 유전자 ⁹ STAT1 활성화하는 동안 immunoprecipitated 보여줍니다.

그림 1. STAT1, RNA 중합 효소 II와 H3K36me3의 인 IRF1 유전자의 STAT1 활성화하는 동안 동적입니다. (A, B, C) ​​α - H3K36me3, α - STAT1과 2FTGH 세포에서 수집한 염색질의 α - 폴 II와 칩 IFN - γ를위한 30 분 (빨간색 사각형), 1.5 시간 (파란색 원), 5 시간 (로 유도 녹색 삼각형) 또는 uninduced (블랙 다이아몬드). IgG는 대조군 (회색 십자가)입니다. (D) 팬 H3는 긍정적인 제어이며, 유도 (파란색 원)에 로커스 전체 히스톤 인과 uninduced 조건 (블랙 다이아몬드)를 보여줍니다. -5 BP 주변 딥는 전사 시작 사이트에서 발견 nucleosome 고갈로 인한 것입니다.

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토론

명시된 칩 프로토콜은 분석보다보다 20 가지 히스톤 수정을 위해 실험실에서 성공적으로 사용되었습니다. 또한, 우리는 전사 요소의 숙박 변화를 특징으로 가지고 히스톤 - 수정 IFN - γ 여러 유발 유전자에서 히스톤 수정 및 RNA 효소 II의 전사 기계를 인식 효소, 단백질. 우리는 또한 암 줄기 세포 ¹⁰ 분화 동안 히스톤 수정의 변화를 특징으로 프로 시저를 사용합니다.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	BP531-500
Chloroform/Isoamyl alcohol	Acros Organics	AC32715-5000
Complete Mini Protease Inhibitors	Roche Group	1836153
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.04N
DMEM	Hyclone	SH30243
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500
Ethanol	Pharmco Products, Inc.	zp1110EP
Glycine	Roche Group	100149
Glycogen	Roche Group	901393
HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
IFN-gamma	R&D Systems	285-IF-100
IgG	Jackson ImmunoResearch	109-005-003
KCl	MP Biomedicals
LiCl	Sigma-Aldrich	L4408
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Sodium Acetate	Fisher Scientific	BP333-500
Deoxycholic Acid Sodium Salt	Fisher Scientific	BP349-100
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5
NP40	US Biological	N3500
Anti-Histone H3, CT, pan	EMD Millipore	07-690
Phenol/chloroform/isoamyl	Fisher Scientific	108-95-2
Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	7647-14-5
PMSF	EMD Millipore	50-230-0316
Proteinase K	5 PRIME	2500140
RNAse A	5 PRIME	2500130
Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose	EMD Millipore	16-157
Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse	EMD Millipore	16-201
SDS	Fisher Scientific	BP166-500
Tris-Cl	Sigma-Aldrich	T5941
Triton X-100	Acros Organics	327372500
Anti-K36me3	Abcam	ab9050
Anti-STAT1	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-345X
Anti-RNA Polymerase II	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-899