Хроматин Иммунопреципитация (чип) с Пробирной Динамический гистонов Внесение изменений в Активированный экспрессии генов в клетках человека

Резюме

Этот протокол описывает, как хроматин иммунопреципитации (чип) используется для изучения динамических изменений хроматина шаблон, который регулирует транскрипцию индуцированных пути передачи сигнала.

Аннотация

В ответ на различные внеклеточные лиганды, STAT (преобразователь сигнала и активатор транскрипции) транскрипционные факторы быстро набираются из своего латентного состояния в цитоплазму, чтобы рецепторами клеточной поверхности, где они приводятся в действие фосфорилирования в одной остаток тирозина ^1. Затем они димеризуются и транслокации в ядро ​​для управления транскрипцию генов-мишеней, влияющих на рост, дифференцировку, гомеостаза и иммунного ответа. Не удивительно, учитывая их широкое вовлечение в нормальных клеточных процессов, нарушение регуляции функции STAT способствует болезни человека, в частности, рака ² и аутоиммунных заболеваний ^3.

Хорошо известно, что транскрипции регулируется изменений хроматина шаблон ^4,5. Эти изменения включают деятельность АТФ-зависимых комплексов, а также ковалентные модификации гистонов и метилирования ДНК ^6. Потому что СТАТ активации экспрессии генов является одновременно быстрый и преходящее, она требует конкретных механизмов для модуляции хроматина шаблон на STAT-зависимых локусы генов. Чтобы определить эти механизмы, мы характеризуем модификации гистонов и ферментативных активностей, которые их в генных локусов, которые отвечают на STAT сигнализации. Этот протокол описывает хроматин иммунопреципитации, метод, который является ценным для изучения СТАТ сигнализации с хроматином в активированных экспрессии генов.

протокол

ПЛАНИРОВАНИЕ

Накануне ChIP эксперимента планируется, камеры должны быть культурными, так что их достаточное число. Предположим, что каждый чип анализа потребуется ~ 1-1,5 х 10 ⁷ клеток. Всегда планирую сделать как отрицательное (IgG) и положительных (панорамирование гистонов антитело) управления и дублировать эксперименты.
Совет - Для 2FTGH клеток, каждый чип анализ требует около 15 см культуре ткани блюдо на 80% слияния.

ЧАСТЬ 1: Подготовка ХРОМАТИНА и выполнять ChIP

1. Удалить культуру средств массовой информации и вызывают клеток для раз требуется 20 мл 10% космических телячьей сыворотки (CCS) / DMEM содержащие интерферон-гамма в 5 нг / мл. Замените СМИ uninduced пластин с 20 мл 10% CCS / DMEM, а также.
2. В вытяжной шкаф, добавить 540 мкл 37% формальдегида в 20 мл среды (1% конечная концентрация) в 15 см блюдо.
   Совет - Tilt тарелку и добавить формальдегид в пул носителей - то каменную плиту, чтобы распространить ее равномерно.
3. Разрешить сшивания проводили в течение 10 минут при комнатной температуре.
4. Добавить глицина до 0,125 М конечной концентрации, чтобы остановить сшивания.
5. Вакуумная аспирация СМИ и промыть клетки один раз с 10 мл ледяной фосфатным буферным раствором (PBS).
6. Сбор клетки с клеткой скребок в ~ 7 мл PBS и объединить клетки (из 6 пластин), которые лечились одинаково в 50 мл коническую трубку на льду.
7. Центрифуга (Beckman Coutler Allegra 12-R Центрифуга) при 1800 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 5 минут и аспирации PBS.
   Совет - Snap заморозить осадок клеток, если остановка здесь и хранить при температуре -80 ° C.
8. Ресуспендируют осадок клеток в 4 мл Отек буфера (25 мМ HEPES рН 7,8, 1,5 мМ MgCl _2, 10 мМ KCl, 0,1% NP40. Добавить 1 мМ DTT, Полная ингибиторов протеазы и холод на лед перед использованием) и трансфер в 15 мл коническую трубку.
   Совет - это отек объем буфера подходит для 6 пластин объединения (~ 6-9 х 10 ⁷ клеток). Более или менее буфера может измениться douncing эффективности.
9. Инкубируйте клеточной суспензии на льду в течение 10 минут.
10. Передача подвески предварительно охлажденное 15 мл douncer (Уитон) и Dounce 20 ударов с пестиком А.
11. Передача dounced клетки обратно в 15 мл коническую трубку на льду.
12. Центрифуга при 2500 оборотов в минуту в течение 5 минут при 4 ° С и отбросить супернатант.
13. Ресуспендируют ядерной гранул (~ 200 мкл из 6 пластин) в 3 мл (15 гранул объемов) ультразвуком буфера (50 мМ HEPES рН 7,9, 140 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон Х-100, 0,1% натрия дезоксихолатом, 0,1% SDS. Добавить Полное ингибиторов протеазы и холод на лед непосредственно перед использованием).
    Совет - Этот объем буфера ультразвуком подходит для 6 пластин объединения (~ 6-9 х 10 ⁷ клеток). Более или менее буфера может измениться ультразвуком эффективности.
14. Разрушать ультразвуком ядер подвески на льду в течение 10 циклов (20 секунд on/40 секунд выкл / амплитуда установка 8), используя Sonicator Misonix 3000 оснащен микроострийных. Это обычно приводит фрагменты хроматина среднем 200-1000 бит в размерах.
    Совет - Потому что sonicators будет меняться, ультразвука эффективность должна определяться опытным путем. Чтобы сделать это, возьмите аликвоты 20 мкл до ультразвука и после каждого цикла обработки ультразвуком. Тепло этих образцов при температуре 65 ° С в течение 4 часов. Добавить буфера ДНК загрузки и запуска стандартного 1% агарозном / TBE геля для визуализации фрагментов ДНК.)
    
15. Передача ультразвуком материал для SS34 центрифужную пробирку и центрифуги в течение 20 минут при 4 ° С при 13000 оборотов в минуту в SS34 ротора (Sorvall RC6 Плюс центрифуги) в гранулах, что, как правило, небольшое количество клеточного мусора.
16. Тщательно передачи супернатант в 15 мл коническую трубку на льду.
17. Предварительно ясно, добавив 360 мкл ДНК спермы лосося / Белок или G агарозном бисером шлама и качалки при 4 ° С в течение не менее 30 минут.
    Совет - Этот шаг уменьшается шум в анализе, которое возникает из неспецифического связывания событий.
18. Центрифуга при 1000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 5 минут, чтобы гранулы агарозном бисером.
19. Передача предварительно очищен супернатант в другой 15 мл коническую трубку на льду.
20. Мера A260 единиц предварительно очищен хроматина и регулировать громкость с помощью ультразвука буфера до четырех (4) A260 единиц (0,2 мг / мл, предполагая 1 A260 единица = 0,050 мг / мл)
    Совет - Для измерения A260 единиц, развести 10 мкл предварительно очищен хроматина в 190 мкл DDW; пустой спектрофотометр с 10 мкл буфера ультразвука в 190 мкл DDW.
    
21. Сохранить 75 мкл хроматина (при 4 A260 шт.) в Пример входных данных и храните при температуре 20 ° С до готовности отменить сшивки.
    Совет - Этот шаг имеет решающее значение для анализа данных. Не пренебрегайте принять входной аликвоту.
    
22. Алиготе подготовлены хроматина до 1,7 мл пробирок микроцентрифужную на ясе, как 1 мл аликвоты.
    Совет - Если остановка здесь, оснастки заморозить подготовлены хроматина на сухом льду и хранить при температуре -80 ° C. NB: хранить хроматина может привести к снижению, производя меньше, чем оптимальные результаты, поэтому следует избегать, если это возможно.
    
23. Добавить ChIP класса антител к индуцированных и uninduced образцы наборов в двух экземплярах. Добавить IgG (2 мкг) и пан гистонов H3 антитела (15 мкл), а отрицательные и положительные элементы управления для индуцированных и uninduced образцы наборов.
    Совет - количество антител использовать, должен быть определен эмпирически или смотрите лист поставщика для предлагаемых сумм. Обычно 1-2 мкг ChIP класса антител, работает хорошо. Соответствующий объем должен быть определен эмпирически для антител, которые поставляются в сыворотке крови.
    
24. Рок все трубы на ночь при 4 ° C.

ЧАСТЬ 2: COLLECT иммунных

1. Добавить 60 мкл ДНК спермы лосося / белка или белка G суспензии агарозы бисера для всех трубок.
   Белки Совет Используйте для кролика поликлональных антител и белков G для мышиных моноклональных антител.
2. Рок при 4 ° С в течение не менее 60 минут.
3. Гранул иммунных комплексов (агарозном бусы) по microfuging мягко при 2000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С в течение 3 минут.
4. Аспирируйте супернатант.
5. Вымойте иммунных комплексов с 1 мл каждого из следующих буферов вымойте в течение 10 минут с качающимися при 4 ° C. Микроцентрифужную в течение 3 минут при 2000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C между каждой стирки и аспирации супернатант. Храните образцы охлажденной на льду. Добавить PMSF непосредственно перед использованием.
   • Низкий Вымойте соль - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ EDTA, 20 мМ Трис-Cl, рН 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ PMSF
   • Высокая Вымойте соль - 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ EDTA, 20 мМ Трис-Cl, рН 8,0, 500 мМ NaCl, 1 мМ PMSF
   • LiCl Wash - 0,25 М LiCl, 1% NP-40, 1% натрия дезоксихолата, 1 мМ EDTA, 10 мМ Трис-Cl, рН 8,0, 1 мМ PMSF
   • TE Wash - ДВА Моет с TE буфера -10 мМ Трис-Cl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF
6. Удалить окончательного буфера TE мыть и бусы, добавить 500 мкл буфера элюции (50 мМ Трис-Cl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 1% SDS).
   Совет - элюции буфера должны быть готовы свежие решения.
   
7. Vortex смешать агарозном бусины буфера элюции и тепла в течение 30 минут при температуре 65 ° C.
   Совет - вихрь каждую пробирку по крайней мере каждые 10 минут в течение этого 30 минут.
8. Микроцентрифужную в течение 30 секунд при 2000 оборотах в минуту и ​​передачи элюента в новую пробирку и отцентрифугировать.
   Совет - Во время элюирования, оттепель ваши образцы входных и добавить 500 мкл буфера элюции для каждого из них. Включите эти образцы на всех этапах продвижения вперед.
   
9. Добавьте 5 М NaCl до конечной концентрации 200 мМ для всех образцов и вихря.
10. Инкубировать при 65 ° С в течение ночи (или по крайней мере 4 часа).

ЧАСТЬ 3: очистить ChIP'd И ВВОД ДНК

1. Микроцентрифужную всех образцов в течение 30 секунд для сбора конденсата на крышках.
2. Добавить 1 мкл РНКазы (10 ед / мкл) в каждую пробирку и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 минут.
3. Добавьте 10 мкл 0,5 М ЭДТА, 40 мкл 0,5 М Трис-Cl рН 6,5, 2 мкл протеиназы К (10 мг / мл) и инкубируют при 45 ° С в течение 60 минут. Совет Подготовка мастер сочетание этих реагентов и добавить 52 мкл в каждую пробирку.
4. Фенол / хлороформ / изоамиловый спиртовой экстракт, а затем хлороформ / изоамиловый спиртовой экстракт образцов.
5. Добавьте 2 мкл гликогена (25 мкг / мкл) и 0,1 объемов 3М ацетата натрия рН 5,2 и вихря.
6. Добавить 2,5 объемами 100% этанола и вихря.
7. Инкубировать при 20 ° С в течение ночи.

ЧАСТЬ 4: очистить ChIP'd И ВВОД ДНК ПРОДОЛЖЕНИЕ

1. Микроцентрифужную образцы в течение минимум 20 минут при 13000 оборотов в минуту при температуре 4 ° С для осаждения ДНК / гликогена гранул.
2. Промыть ДНК / гранулы гликогена с 1 мл 70% этанола.
3. Воздух сухой гранулы или быстро сохнут в ДНК Savant центрифуги вакуум скорости.
   Совет - не более сухой ДНК.
4. Ресуспендируют ДНК / гликогена гранул в 200 мкл буфера ТЕ.
5. ДНК (1 мкл) готов к количественному помощью ПЦР в реальном времени. Магазин оставшиеся ДНК при 20 ° C.
   Совет - Использование более 1 мкл ДНК может ингибировать ПЦР в реальном времени реакции, поэтому масштабы с осторожностью.

Часть 5: репрезентативные результаты:

Образцы чипа и входного ДНК количественно ПЦР в реальном времени ^7,8 (Applied Biosystems 7500 Быстрый ПЦР в реальном времени система) с использованием праймеров, специфичных для локуса гена интересов. Грунтовки, что цель геномной последовательности, как известно, обогащенные или не хватает в модификации гистонов быть проанализированы может быть использован как положительный и отрицательный контроль, а также. Данные представлены в процентах от входа. ChIP процедура должна быть полностью тepeated с тремя биологическими репликацию для обеспечения об изменениях в модификации гистонов являются статистически значимыми.

Есть несколько важных вопросов, которые следует учитывать при использовании ПЦР в реальном времени количественно ДНК, в том числе праймеров, ПЦР эффективности и соответствующим образом для расчета процентов входной и нормализацию процедуры. При профилировании гистонов размещение модификации по гену, эффективность ПЦР должны быть согласованы между всеми пар праймеров. ПЦР в реальном времени системы производитель может предоставить необходимую информацию и обучение.

На рисунке 1 показан представителю результаты иммунопреципитации хроматина во время STAT1 активация гена IRF1 ^9, вызванных IFN-γ.

Рисунок 1. Заполняемость STAT1, РНК-полимеразы II и H3K36me3 динамична во STAT1 активация IRF1 гена. (A, B, C) ​​чип с α-H3K36me3, α-STAT1 и α-Pol II хроматина собраны из 2FTGH клетки с индуцированной ИФН-γ в течение 30 минут (красные квадраты), 1,5 часов (синие кружки), 5 часов ( зеленые треугольники) или uninduced (черные алмазы). IgG является отрицательного контроля (серые кресты). (D) Пан H3 является положительным контролем и показывает гистонов размещение через локус в индуцированной (синие кружки) и uninduced условиях (черные алмазы). Падение около -5 б.п. происходит из-за истощения нуклеосом, что находится в местах старта транскрипции.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

ChIP протоколе изложены успешно используется в лаборатории для анализа более чем двадцати различных модификаций гистонов. Кроме того, мы охарактеризовали изменения в размещении транскрипционных факторов, гистон-модифицирующие ферменты, белки, которые признают модификации гистонов и ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
37% Formaldehyde	Fisher Scientific	BP531-500
Chloroform/Isoamyl alcohol	Acros Organics	AC32715-5000
Complete Mini Protease Inhibitors	Roche Group	1836153
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.04N
DMEM	Hyclone	SH30243
DTT	Sigma-Aldrich	D0632
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500
Ethanol	Pharmco Products, Inc.	zp1110EP
Glycine	Roche Group	100149
Glycogen	Roche Group	901393
HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
IFN-gamma	R&D Systems	285-IF-100
IgG	Jackson ImmunoResearch	109-005-003
KCl	MP Biomedicals
LiCl	Sigma-Aldrich	L4408
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
Sodium Acetate	Fisher Scientific	BP333-500
Deoxycholic Acid Sodium Salt	Fisher Scientific	BP349-100
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5
NP40	US Biological	N3500
Anti-Histone H3, CT, pan	EMD Millipore	07-690
Phenol/chloroform/isoamyl	Fisher Scientific	108-95-2
Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	7647-14-5
PMSF	EMD Millipore	50-230-0316
Proteinase K	5 PRIME	2500140
RNAse A	5 PRIME	2500130
Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose	EMD Millipore	16-157
Salmon Sperm DNA/Protein G Agaorse	EMD Millipore	16-201
SDS	Fisher Scientific	BP166-500
Tris-Cl	Sigma-Aldrich	T5941
Triton X-100	Acros Organics	327372500
Anti-K36me3	Abcam	ab9050
Anti-STAT1	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-345X
Anti-RNA Polymerase II	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-899