דיפרנציאל הדמיה של מבנים ביולוגיים עם פיזור כפליים-התהודה אנטי סטוקס קוהירנט ראמאן (CARS)

Summary

שילוב של שלוש קצר פעמו לייזר באורך גל יחיד משמש ליצור פיזור קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS) ומכוניות כפליים-התהודה (DR-CARS). ההבדל בין אותות אלה מספק רגישות משופרת אחרת קשה לזהות אותות ראמאן קוהרנטית, המאפשר הדמיה של scatterers ראמאן חלש.

Abstract

קוהירנט שיטות הדמיה ראמאן ראינו עלייה דרמטית בפעילות בעשור האחרון, בשל הבטחתם לאפשר ללא תווית הדמיה אופטית עם סגוליות גבוהה מולקולרית ^1. הרגישות של טכניקות אלה, לעומת זאת, הזמנות רבות של עוצמת הקרינה חלשה יותר, המחייב מילי טוחנת מולקולרית ^1,2 ריכוזי. כאן אנו מתארים טכניקה שיכולה לאפשר גילוי ריכוזים חלש או נמוך של ראמאן פעיל מולקולות על ידי הגברה האות שלהם עם זה המתקבל scatterers ראמאן חזק או עשיר. האינטראקציה של לייזרים של פולסים קצרים מדגם הביולוגי מייצר מגוון רחב של קוהרנטית אותות פיזור ראמאן, שכל אחד מהם לשאת מידע כימי ייחודי על המדגם. בדרך כלל, רק אחד האותות הללו, למשל פיזור קוהרנטית אנטי סטוקס ראמאן (CARS), משמש ליצירת תמונה בעוד אחרים מבוטלים. עם זאת, כאשר האותות הללו אחרים, כולל 3-צבע מכוניות ארבעה גל ערבוב (FWM), נאספים לעומת האות המכוניות, אחרת קשה לזהות מידע ניתן לחלץ ^3. לדוגמה, מכוניות כפליים-התהודה (DR-CARS) הוא תוצאה של התערבות בונה בין שני אותות התהודה ^4. אנו מדגימים כיצד כוונון של שלוש לייזרים הנדרש כדי לייצר מכוניות DR-אותות 2845 הרטט ^-1 ס"מ למתוח CH שומנים לבין 2,120 ^-1 ס"מ תקליטור רטט מתיחה של מולקולה deuterated (סוכרים deuterated למשל, חומצות שומן, וכו ') יכול להיות מנוצל כדי בדיקה גם תהודות ראמאן בו זמנית. בתנאים אלה, בנוסף אותות מכוניות תהודה כל אות משולב DR-CARS חיטוט הן מופק גם. אנו מדגימים כיצד לזהות את ההבדל בין אות DR-המכוניות ואת האות הגברה של רעידות מולקולה של שפע יכול לשמש כדי לשפר את הרגישות לאות החלש. בנוסף, אנו מראים כי גישה זו אף מרחיב את יישומים בהם הן אותות נוצרות ממולקולות שונות, כך למשל באמצעות האות ראמאן חזקה של ממס יכול לשפר את האות ראמאן חלש של המומס לדלל.

Protocol

1. דור של מכוניות DR-CARS איתותי

על מנת לייצר מכוניות DR-CARS אותות בעת ובעונה אחת, שלושה מקורות מתכונן מסונכרן קצר לייזר פעמו נדרשים.

1. כדי לקבל שלוש פעימות מסונכרן נתחיל עם אחת 10 W לייזר (PicoTrain, HighQ לייזר, Inc). לייזר זה אורך גל קבוע של 1064 ננומטר, אורך פולס קבוע של 7 ps, ושיעור החזרה קבוע של 76 MHz.
2. באמצעות סדרה של חצי גל צלחות מקטב קרן splitter קוביות קרן מחולק לשלושה חלקים. צלחת חצי גל בשילוב עם קובייה מקטב קרן splitter מאפשר לנו להתאים את כמות כוח כל רכיב של הקורה מבלי לשנות את הכיוון שלו. בדרך כלל, שתי אלומות מותאמים ~ 4.5 ואט כל אחת, את קרן third מכיל את הנותרים 1 וו
3. שתי אלומות בהספק גבוה מופנים אז לשתי מתנדים עצמאי פרמטרי אופטי (OPO של, Avante, APE GmbH, ברלין, גרמניה). ההבדל להשתמש OPO של תדר הדור להמיר פוטון אנרגיה גבוהה יותר לשני פוטונים עם אנרגיה נמוכה יותר באורכי גל שונים. על ידי שליטה על הטמפרטורה של גביש המשמש להשיג את האפקט הזה, אורכי הגל של הפוטונים וכתוצאה מכך ניתן לשלוט בתוך 0.1 ננומטר. על ידי הכפלת תדר האותות הללו, לייזר עם אורך גל קבוע של 1064 ננומטר כעת ניתן להפוך קרן לייזר כי יכול להיות מכוון מקום בין 780 ננומטר עד 910 ננומטר. על ידי שאיבה של שני נפרד OPO עם מקור זהה 1064 ננומטר, נקבל שני מקורות לייזר מתכונן באופן עצמאי כי מסונכרנים באופן אוטומטי לייזר המשאבה המקורית שלנו.
4. הקרן השלישית (ההספק הנמוכה ביותר) של לייזר 1064 ננומטר משאבת מכוונת סביב זה OPO על ידי שילוב של מראות dichroic כך כל שלוש אלומות (2 מ OPOs, 1 מ לייזר המשאבה) ניתן recombined מאוחר יותר. על מנת לייצר ביעילות קוהרנטית פוטונים אות ראמאן קטניות recombined חייבת להיות חפיפה הן temporally מרחבית. בגלל זה OPO מכילים חללים הטבעת, המאפשר לכל הדופק לייזר לעבור דרך מספר רב של פעמים קריסטל, קורות שנשלח באמצעות נסיעה של OPO המרחק הנוסף וכתוצאה מכך עיכוב ניכר ביחס הקורה משאבה מקורית. מרחק זה חייב להיות מתוגמל עבור עם קרן השלישי ידי הצגת מראות כי תוספת כוח קרן זה לנסוע את אותו המרחק כמו השניים האחרים לפני שהם recombined שימוש במראות dichroic.
5. על מנת לספק התאמה קנס של אורך השביל הקורה כל נוסע בשלבים עיכוב מתכווננת, באמצעות retroreflectors פריזמה, מוכנסים כל נתיב קרן.
6. קבוצה נוספת של חצי גל צלחות מקטב קרן קוביות ספליטר מתווספים כל הקורה כדי לאפשר לנו להתאים את העוצמה של כל קרן באופן עצמאי מבלי להשפיע על הקלט של OPO של.
7. מראות dichroic משמשים קודם לשלב את קורות משתי של OPO ולאחר מכן עם קרן 1064 ננומטר. יש להקפיד על מנת להבטיח כי הקורות הם חפפו במדויק (כלומר הם קוליניארי יש סטייה דומה). זה יכול להיבדק על ידי השוואת חפיפה של קורות קרוב (בתוך כמה סנטימטרים) ורחוק במראה (~ 1 מ ') dichroic.
8. היתרון של שימוש בלייזרים פעמו היא הדופק כל יכול להיות שיא אנרגיה גבוהה המדגם, המאפשר לדור יעיל של אותות ראמאן קוהרנטית, תוך שמירה על עוצמת הממוצע נמוך. עוצמת ממוצע גבוה יכול לגרום נזק המדגם. לכן על מנת להמשיך לשלוט על עוצמת הממוצע מבלי להקריב אנרגיה שיא, שלוש קורות בשילוב נשלחים דרך אפנן אלקטרו אופטיים (תא של Pockel, ConOptics) מתפקד בורר דופק, אשר מאפשר לנו להתאים את קצב החזרה של פולסים כי מגיעים המדגם שלנו ולכן עוצמת הממוצע.
9. קרני לייזר משולב הם מצמידים מכן לתוך מיקרוסקופ הפוכה עם מטרה NA גבוה. המטרה היא בדרך כלל 60 X אובייקטיבי מים עדשה עם צמצם מספרית (NA) של 1.2 כי תוקנה על סטייה כרומטית על פני טווח של tunability של OPO שלנו הקורה 1064 ננומטר. חזק התמקדות שנוצר על ידי העדשה NA גבוה אובייקטיבי מאפשרת לדור היעילה ביותר של אותות ראמאן קוהרנטית בסולם מיקרון.
10. קורות בשילוב מורחבות כדי overfill האחורי יציאת המטרה מיקרוסקופ. עד שגדשו את החלק האחורי של המטרה מיקרוסקופ אנו יכולים להשיג את התנאים הטובים ביותר התמקדות ולכן ברזולוציה מרחבית הטובה ביותר במערכת מיקרוסקופ שלנו.
11. העדשה אובייקטיבי מיקרוסקופ שלנו הוא רכוב על הבמה XYZ piezo שמאפשר לנו לקבל תמונות על ידי סריקה לסריקת הקורות על פני המדגם, בדומה הקורה סריקת מיקרוסקופ מסחרי confocal.

2. השימוש שלושה לייזרים קצר פעמו

שימוש של שלושה לייזרים קצר פעמו תוצאות בייצור של אותות כמה מכוניות, החל ג השונותombinations של שני לייזרים, כמו גם 3-Color מכוניות DR-FWM אותות משילוב של כל שלושת לייזרים.

1. אורכי הגל של האותות יכול לשקר spectrally קרובים זה לזה. כאשר אותות קרובים זה יכול להיות קשה להפריד ביניהם לניתוח שימוש קבוע bandpass גל מסננים ומראות dichroic. מסיבה זו האותות שלנו מועברים לתוך ספקטרומטר ההדמיה (SpectraPro 2300i, אקטון Research), אשר משמש גם monochromator יעילה במרחב נפרד אותות באורכי גל שונים.
2. המראה להעיף actuated אלקטרונית בתוך הספקטרומטר בעמדה הוריד שולח את האות בחזרה מואר דלדול עמוק מצלמה תשלום מצמידים מכשיר (CCD) המספק מידע ספקטרוסקופיות על פני טווח האות כולו מאפשר לנו לזהות לייעל את קוהרנטית שונים ראמאן אותות.
3. כדי לבחור את האות שבה אנו רוצים תמונה אנחנו פשוט לסובב את הסורג בתוך הספקטרומטר, באמצעות המסופקים מלאה רכישת נתונים תוכנה (WinSpec, פרינסטון מכשירים), למרכז השיא של הריבית על מצלמת CCD ולאחר מכן לשנות את המיקום של המראה להעיף להפנות את האות ליציאת היציאה השנייה שבה מפולת פוטון יחיד לספור צילום דיודה (APD) חובר.
4. העדשה היא המטרה אז raster-שנסרקו את האותות נרשמות על APD הם השתמשו כדי ליצור תמונה על ידי הצגת פוטון לספור שער עבור כל פיקסל באמצעות תוכנה רכישת נתונים (SymPhoTime, Picoquant GmbH, ברלין, גרמניה).
5. אנו חוזרים על הליך זה עבור הדמיה האות הרצויה בכל ראמאן קוהרנטי אשר מאפשר לנו להשוות את האותות במהלך שלאחר עיבוד.

3. לדוגמא הכנה

על מנת לקבל ברורה, תמונות לשחזור טיפול כלשהו חייב להילקח בהכנת המדגם.

1. דוגמאות מוכנים בדרך כלל על 150 ~ coverslips מיקרון זכוכית עבה. Coverslips אלה הם דקים מספיק כדי לאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה עם 1.2 מטרות NA המשמשים בדרך כלל.
2. לכידה אופטית של עצמים דיאלקטרי יכול להתרחש כאשר אור הלייזר הוא diffracted דרך עצמים שקופים קטנים. השימוש כוח, ממוקדת היטב שיא גבוהה, קצר קרני לייזר פעמו מכן ניתן לגרור תאים קטנים או חיידקים יחד, וכתוצאה מכך תמונות מטושטשות או מרוחות. כדי למנוע זאת זה עשוי להיות נחוץ כדי לשתק את המדגם על פני השטח של coverslip הזכוכית על ידי הראשון מריחת שכבה דקה של פולי-L-ליזין ידי ציפוי ספין.
3. עבור תאים בתרבית תחתית זכוכית מנות התרבות יכול להיות מנוצל המאפשרים הדמיה ללא צורך לנתק את התאים מן התרבות התא שלהם מנות צמיחה.
4. עבור הפגנה תרומה זו אנו הראשון פיקדון פורמלדהיד-קבוע C. elegans תולעת נמטודות על פיסת כיסוי זכוכית.
5. ואז להוסיף טיפה 20 μL של פתרון M 5 גלוקוז deuterated על התולעת. הפתרון מספק גלוקוז deuterated חתימה ייחודית וחזקה רקע ראמאן.

4. לדוגמא ניתוח

כדי לנצל כראוי אפקט שיפור כפליים-התהודה הספקטרום של שני ראמאן ראמאן-התהודה חומרים חייב להיות ידוע.

1. לאחר המדגם הוא מוכן על coverslip הוא ניתח באמצעות מיקרוסקופ ראמאן confocal לקבל את ספקטרום ראמאן רלוונטי ספונטנית לזהות פסגות מתאים.
2. כדי לבצע DR-CARS לנו לזהות את מיקומי הרפאים של מצב למתוח CH, הקשורות בדרך כלל שומנים, ואת מצב למתוח CD, הקשורים גלוקוז deuterated, כי 2845 ו - 2121 ס"מ ^-1 ס"מ ^-1 בהתאמה.
3. פיזור ראמאן קוהירנט מושגת כאשר ההבדל בין שני לייזרים תדר תואם את תדירות הרטט מולקולרית. על ידי כוונון OPO אחד 817 ננומטר זה יהיה לחקור את 2845 ^-1 ס"מ מצב CH בשילוב עם אלומת לייזר 1064 ננומטר ידי כוונון OPO אחרים 868 ננומטר זה יהיה לחקור את השיא 2,121 ^-1 ס"מ בשילוב עם קרן 1064 ננומטר .
4. על ידי סריקה לסריקת המדגם על מיקרוסקופ המכוניות עכשיו אנחנו יכולים להתבונן three אותות ראמאן קוהרנטית של עניין. מכוניות אות לחקור את CH מתיחה רטט, מכוניות אות לחקור את מצב המתיחה CD, ואת אות DR-CARS חיטוט שניהם.
5. אנו בוחרים כל שיא כמתואר בסעיף 2.3 ולקחת תמונה כפי שתואר לעיל.

5. עיבוד תמונה

מחלץ מידע נוסף על שלושת התמונות כעת דורש עיבוד תמונה פשוטה למדי.

1. ראשית תמונות חייב להיות תקין. ב נורמליזציה התיאוריה יכולה להיות מושגת על ידי החשבונאי עוצמת הלייזר כל המעורבים בתהליך כל דור האות. אולם בפועל זה לא תמיד עובד, בעיקר עקב תגובה לא אחידה רפאיםמראות, גלאי dichroic, ומסבכות.
2. שיטה מעשית נורמליזציה מסתמך על העובדה כי באזורים בהם שומנים טהור להשתלט על האות, את התהודה CD לא צריך לתרום כל האות. כמו כן, באזורים של פתרון גלוקוז טהור התהודה CH לא צריך לתרום כל האות. לאור זאת, אנו לנרמל את התמונה DR-מכוניות התמונה מכוניות מתקבל על תהודה את התקליטור של הפתרון גלוקוז deuterated לאזור גם מחוץ C. elegans תולעת צריך להפגין אין תהודה CH.
3. אז אנחנו לזיהוי אזור בתוך התולעת בתמונה מכוניות CH-התהודה כי הוא עשיר שומנים לנרמל אותו לאזור המתאים בתוך התמונה DR-CARS מנורמל. בשיטה זו כדי לעבוד כמו שצריך אנו מניחים כי עמוק בתוך האזור הזה לא הגלוקוז deuterated הוא ההווה. זוהי הנחה בטוחה מאז שומנים הם הידרופובי ולא לערבב עם הפתרון.
4. כעת, על ידי הפחתת תמונה מנורמל CH-התהודה מכוניות מהתמונה DR-CARS מנורמל נותרנו רק עם האות CD-התהודה מוגבר.
5. באופן דומה על ידי הפחתת תמונה מנורמל CD-התהודה מכוניות מהתמונה DR-FWM מנורמל אנחנו נשארים עם CH-מהדהד רק אות מוגבר.

6. נציג תוצאות

איור 1: תרשים של מערכת DR-CARS מיקרוסקופיה כמתואר לעיל.

איור 2: תמונה האור הלבן של ג תולעת elegans בפתרון גלוקוז deuterated מוכן על coverslip כוס ומוכן הדמיה.

איור 3:. ספקטרום ראמאן של חומצה אולאית שונה (חומצת שומן בלתי רוויות) הכולל שינוי alkyne (משולשת הקשר פחמן פחמן קבוצה) תהודות CH חזק ב 2845 ו ^-1 ס"מ תהודה alkyne ב ^-1 ס"מ 2100 הן מבודד היטב מאזור טביעת אצבע (האזור של פסגות בצפיפות), מה שהופך אותם סמנים אידיאלי עבור הדמיה ראמאן קוהרנטית.

איור 4:. ספקטרום אופייני של אותות ראמאן קוהרנטית שנוצר כאשר שלושה קצר פעמו לייזרים הם חופפים בתוך המדגם החיצים מצביעים על תהליך (ES) אחראי על כל אות כמו מיוצג על ידי דיאגרמות אנרגיה. ב דיאגרמות המוצג כאן החצים מצביעים מקווקו פוטונים מקרינת הלייזר ואת OPO של וחצים מוצק לציין את האות שהתקבל. קווים אופקיים מוצק לציין את האנרגיה של הרטט ראמאן ולתת ייצוג חזותי, כי DR-CARS, ערבוב אותו 3 פוטונים קלט בו זמנית בדיקות two תנודות ראמאן שונים.

איור 5: תוצאות אופייניות של הדמיה ג elegans תולעים באמצעות DR-מכוניות מכוניות. השורה העליונה השתמשו בשלושת האותות המצוין באיור 4 לתמונה תולעת בתמיסה של גלוקוז deuterated. בשורה השנייה התמונות היו מנורמל הולם בשורה השלישית את התמונות ההבדל הופקו על ידי הפחתת כל התמונות מכוניות תמונה DR-המכוניות.

Discussion

ספקטרוסקופיית ראמאן ראמאן מבוססות הדמיה הם כלים חדשים רבי עוצמה בתחום מדעי ביו. נכון לעכשיו, זה נכון במיוחד עבור in vivo ו במחקר במבחנה של חילוף החומרים התאי והפרעות מטבוליות עיבוד ואחסון של שומנים. רוב ביו מקרומולקולות מכילים כמות גדולה של איגרות חוב דומות מולקולרית בעיקר מבוססי פחמן, כך ספקטרום ראמאן המתקבל תאים ואורגניזמים הם בדרך כלל פיתול של תרומות שומנים, חלבונים, חומצות גרעין, סוכרים, שומנים וכו 'קל יחסית כדי לבודד מן הספקטרום הללו מורכבים, בשל נטייתם טופס טיפות צפופה או bilayers ובגלל שהם מכילים שרשראות מורחבת עם מספר רב של אג"ח CH aliphatic. היכולת שלנו כדי לבודד חלבונים ספציפיים, חומצות אמינו, RNA או DNA בתוך הסביבה התאית מורכבת, עם זאת, מוגבלת מאוד. זה נכון במיוחד אם אלה מולקולות של עניין קיימים רק בריכוזים מיקרומטר ומטה. הנה, את היכולת לחקור תהודות ראמאן חלש ניצול הציג את החדשות שלנו DR-CARS הדמיה טכניקה ההבדל מספק גישה רב עוצמה פוטנציאלי עבור microanalysis הכימי שלהם הדמיה. אמנם, את החלק המסובך ביותר של פרוטוקול זה הוא יישור וסינכרון של מערכת לייזר. כאשר מתחיל מאפס, את הסנכרון של קטניות, כלומר להבטיח כי קטניות הן חופפות בזמן למרות מסלולים שונים שהם לוקחים ניתן להקל על ידי שימוש autocorrelator דופק. חפיפה מרחבית לאחר ובזמן מושגת, מכוניות DR-CARS אותות צריכה להתגלות בקלות. עם זאת, יישור הראשון הוא בדרך כלל בוטה, וכתוצאה מכך אותות חלשים. התרגול הטוב ביותר עבור יישור מערכת זו גם היא תחילה לייצר אותות חלשים ולאחר מכן על מנת לשפר את עוצמת האות על ידי tweaking בעדינות את המראות לאורך כל נתיב והתאמת חפיפה הזמני באמצעות בשלבים דיחוי. למרות ספקטרומטר / monochromator משמש לבלבל יעיל מאוד אור בחדר תוצאות הנקייה יכולה להיות מושגת על ידי מערכת ההפעלה עם האורות בחדר כבוי וילונות או צינורות העדשה כדי למזער רקע שהוצגו על ידי אור ממקורות שונים אחרים (כגון מסכי מחשב, חיווי אורות, נוריות וכו ').

ההגדרה שלנו בפרט מנצל פוטון יחיד מפולת צילום דיודה הספירה (APD) גלאי זמן בקורלציה ספירת חומרה פוטון יחיד (TCSPC) לאיתור ^5. זה מאפשר לנו לזהות אותות חלשים מאוד עם רעש נמוך יחסית, אבל קבוצות רבות מצאו צילום מכפיל צינורות (PMT של) עם רווח משתנה יתרון בעת ​​ביצוע מדידות דומות. היתרון של PMT היא שהם מציעים רווח משתנה ויש להם שטח זיהוי הרבה יותר גדול אשר יכול לפשט את היישור של הגלאי. בנוסף, ההגדרה שלנו מנצל בשלבים piezo לתרגם את המטרה על מנת להשיג סריקה הקורה. היתרון של זה היא שיש לנו את היכולת לחזור למקום כלשהו בתוך התמונה הסרוקה בעבר עם רמה גבוהה של דיוק לבצע מדידות נוספות כולל ספקטרום ראמאן ספונטנית. קבוצות אחרות הצליחו ניצול אסיפות ראי סריקה, או כל עוד יחידות סריקה confocal כגון מערכת אולימפוס FluoView, אשר מציע הדמיה הרבה יותר מהר, אך היא מוגבלת ביכולתה לחזור דווקא למקומות שרירותי בתוך תמונה.

כוונון לייזרים כדי להתאים את התהודה ראמאן גם שלב קריטי אשר יחייבו כמה אופטימיזציה. למרות הפסגות ראמאן יכול להיות ידוע את עוצמת מקסימום שיא הספקטרום המתקבל DR-מכוניות מכוניות לא בהכרח מתאימות לכל היותר הפסגה ראמאן ספונטנית. זאת בשל התערבות מהותית של אותות שנוצר על ידי ארבע גל ערבוב המוביל האות הלא מהדהד ברקע ומכוניות, אשר מעוות מכוניות ספקטרה יחסית ספקטרום ראמאן ספונטנית. המיקום הרפאים של השיא של האות המכוניות ניתן לחשב, אך גישה מעשית יותר היא לכוון את OPOs ב, כמה צעדים קטנים על פני הספקטרום המיקום הצפוי של התהודה ראמאן. תהליך זה אמור להניב מקסימום ברור. למעשה, על הרגישות הגדולה של DR-FWM תהודות הן חייב להיות מכוון למקסימום זה.

אחת הבעיות פוטנציאל האחרון הגישה DR-המכוניות יש גם לדון, כלומר את האות DR-CARS יהיה תלוי הפצה הומוגנית של המולקולה ראמאן פעיל הגברה. עבור אובייקטים ביולוגיים ביותר, זה יכול בהחלט להיות תהודה רחבה OH מן המים, שהוא בשפע בכל מקום כמעט. מים, לעומת זאת, מחוץ לאזורים הידרופובי עם תא, כגון טיפות השומנים, המוביל עיוות של האותות המתקבלים כאשר ניצול תהודה מים כדי להגביר מצבי השומנים. בדוגמה שלנו, השתמשנו פתרון של גלוקוז deuterated לייצר אות לזיהוי בקלות ובשפע למדגם הביולוגי שלנו. באופן דומה, deuterated מים או deuterated buffe ביולוגיrs, כגון d-HEPES יכול לשמש. בדוגמה שלנו, שומנים טיפות בתוך ג תולעת elegans היו קטנים מספיק כדי להכיל תמיד, הפתרון deuterated גלוקוז ושומנים בתוך המקום לייזר ממוקדת של המערכת שלנו. עם זאת, הוא בדרך כלל לא נכון. דוגמה מסוים יהיה adipocytes, אשר יוצרים טיפות השומנים די גדול בתוך הציטופלסמה שלהם. זאת אומרת, כל ניסוי שנערך עם טכניקה DR-המכוניות מצריכה הכנה קפדנית וניסיונות לשלוט כדי לאמת את התוצאות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
60X water immersion objective	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW
Inverted Microscope	Olympus Corporation	IX-71SIF-3
Pockels Cell	ConOptics	350-160
Picotrain pump Laser	HighQ	IC-1064-10000
Optical Parametric Oscillator	APE	Levante IR
1.5 Glass cover slips	Fisher Scientific	12-545-102 25cm-1
Half-wave plates	Thorlabs Inc.	AHWP05M-980
Polarizing Beam Splitter Cubes	Thorlabs Inc.	PBS052 or PBS053
Spectrometer/Monochromator	Princeton Instruments/Acton	Spectra Pro 2300i
CCD Camera	Princeton Instruments/Acton	PIXIS: 100B
Avalanche Photo Diode	PerkinElmer, Inc.	SPCM-AGR-14-12691
XYZ Piezo Stage	Physik Instruments	P 733-2CL P 721.CDQ	This is a combination of an XY stage and a Z objective holder
Dichroic Mirrors	Semrock	Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25	These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.
Dichroic Mirror	Chroma Technology Corp.	Z830rdc	To combine the different near-infrared laser beams
TCSPC board	PicoQuant	Timeharp 200
Symphotime Imaging Software	PicoQuant
Matlab	Mathworks