Imagerie différentielle des structures biologiques avec doublement résonnante anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS)

Résumé

Une combinaison de trois simples courte longueur d'onde des lasers pulsés sont utilisés pour générer des anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS) et les voitures doublement résonnant (DR-CARS). La différence entre ces signaux fournit une sensibilité accrue pour les autrement difficiles à détecter des signaux cohérents Raman, permettant l'imagerie de la faiblesse des diffuseurs Raman.

Résumé

Cohérente des techniques d'imagerie Raman ont vu une augmentation spectaculaire de l'activité au cours de la dernière décennie en raison de leur promesse de permettre sans étiquette d'imagerie optique moléculaire élevé avec une spécificité ^1. La sensibilité de ces techniques, cependant, est de plusieurs ordres de grandeur plus faible que la fluorescence, nécessitant milli-molaire ^1,2 moléculaires concentrations. Ici, nous décrivons une technique qui peut permettre la détection de faibles concentrations ou faible actifs Raman des molécules en amplifiant leur signal avec celui obtenu à partir de solides ou abondants diffuseurs Raman. L'interaction des lasers pulsés courts dans un échantillon biologique génère une variété de signaux cohérents de diffusion Raman, chacun de qui transportent l'information chimique unique sur l'échantillon. Typiquement, un seul de ces signaux, par exemple anti-Stokes cohérente diffusion Raman (CARS), est utilisé pour générer une image tandis que les autres sont défaussées. Cependant, lorsque ces autres signaux, y compris 3-couleurs CARS et mélange à quatre ondes (FWM), sont collectés et comparés au signal CARS, autrement difficiles à détecter des informations peuvent être extraites ^3. Par exemple, CARS doublement résonnant (DR-CARS) est le résultat de l'interférence constructive entre les deux signaux de résonance ^4. Nous démontrons comment tuning des trois lasers nécessaires pour produire DR-CARS signaux au 2845 cm ^-1 aux vibrations d'élongation CH dans les lipides et les vibrations 2120 cm ^-1 CD étirement d'une molécule deutérée (par exemple, les sucres deutéré, acides gras, etc) peut être utilisé pour sonder les résonances Raman simultanément. Dans ces conditions, en plus des signaux CARS de chaque résonance, un combiné DR-CARS signal de sonder à la fois est également généré. Nous démontrons comment détecter la différence entre le signal DR-CARS et amplifiant le signal de la vibration d'une molécule abondante peut être utilisée pour améliorer la sensibilité des plus faibles du signal. Nous avons également démontré que cette approche s'étend même à des applications où les deux signaux sont générés à partir de molécules différentes, telles que par exemple en utilisant le signal fort Raman d'un solvant peut améliorer le faible signal Raman d'un soluté dilué.

Protocole

1. Génération de voitures et DR-CARS Signaux

Afin de générer CARS et DR-CARS signaux simultanément, trois accordables et synchronisée courte sources laser pulsé sont nécessaires.

1. Pour obtenir trois impulsions synchronisées nous commençons avec un seul laser de 10 W (PicoTrain, HighQ laser, Inc.) Ce laser a une longueur d'onde fixe de 1064 nm, une longueur d'impulsion fixe de 7 ps, et un taux de répétition fixe de 76 MHz.
2. En utilisant une série de lames demi-ondes et de polarisation du faisceau splitter cubes le faisceau est divisé en trois parties. Une lame demi-onde combiné avec un cube séparateur de faisceau polarisant permet d'ajuster la quantité d'énergie dans chaque composante de la poutre sans changer sa direction. Généralement, deux faisceaux sont ajustés à ~ 4,5 W chacun, et le faisceau troisième contient le solde de 1 W.
3. Les deux faisceaux de forte puissance sont ensuite dirigés en deux indépendantes oscillateurs paramétriques optiques (OPO est, Avante, APE GmbH, Berlin, Allemagne). OPO génération de différence de fréquence utilisez pour convertir un photon d'énergie plus élevée en deux photons d'énergie inférieure avec différentes longueurs d'onde. En contrôlant la température du cristal utilisé pour obtenir cet effet, les longueurs d'onde des photons qui en résulte peut être contrôlée à 0,1 nm. Par doublage de fréquence de ces signaux, un laser avec une longueur d'onde fixe de 1064 nm peut maintenant être transformé en un faisceau laser qui peut être réglée n'importe où entre 780 nm à 910 nm. En pompant deux séparés OPO avec les mêmes sources 1064 nm, on obtient deux sources lasers accordables indépendamment qui sont synchronisées automatiquement à notre laser de pompe d'origine.
4. La troisième (la puissance la plus basse) du faisceau du laser 1064 nm pompe est dirigé vers l'OPO est une combinaison de miroirs dichroïques afin que tous trois faisceaux (2 de l'OPO, 1 du laser de pompe) peuvent être recombinées tard. Afin de produire efficacement des photons signal Raman cohérente des impulsions recombinés doivent se chevaucher à la fois temporellement et spatialement. Parce OPO contiennent des cavités anneau, permettant à chaque impulsion laser de passer à travers les temps multiples de cristal, les poutres envoyé par le voyage de l'OPO est une distance supplémentaire qui entraîne un retard considérable par rapport au faisceau pompe d'origine. Cette distance doit être compensée avec la troisième poutre en introduisant des miroirs supplémentaires que la force de cette poutre pour parcourir la même distance que les deux autres avant qu'ils ne se recombinent en utilisant des miroirs dichroïques.
5. Afin de fournir un réglage fin de la longueur du chemin de chaque faisceau parcourt les étapes retard réglable, en utilisant rétroréflecteurs prisme, sont introduits dans chaque trajet du faisceau.
6. Un autre ensemble de lames demi-ondes et de polarisation du faisceau cubes splitter sont ajoutés à chaque faisceau pour nous permettre de régler la puissance de chaque faisceau de façon indépendante, sans affecter l'entrée de l'OPO est.
7. Miroirs dichroïques sont utilisés d'abord combiner les faisceaux issus de deux OPO et ensuite avec le faisceau de 1064 nm. Des précautions doivent être prises pour s'assurer que les poutres sont précisément chevauchent (c'est à dire qu'ils sont colinéaires et ont des divergences similaires). Ceci peut être vérifié en comparant le chevauchement des faisceaux à proximité (quelques centimètres) et loin de (~ 1 m) le miroir dichroïque.
8. L'avantage d'utiliser des lasers pulsés, c'est que chaque impulsion peut avoir une énergie de pointe élevée à l'échantillon, permettant la génération efficace de signaux cohérents Raman, tout en conservant une intensité moyenne à faible. Une intensité moyenne élevée peut endommager l'échantillon. Par conséquent, afin de mieux contrôler l'intensité moyenne, sans sacrifier l'énergie de pointe, les trois faisceaux combinés sont envoyés à travers un modulateur électro-optique (cellule de Pockels, les ConOptics) fonctionne comme un sélecteur d'impulsion, ce qui nous permet d'ajuster le taux de répétition des impulsions qui arriver à notre échantillon, et donc l'intensité moyenne.
9. Les faisceaux laser combinées sont ensuite couplés dans un microscope inversé avec un objectif de haut de NA. L'objectif est généralement une lentille objectif 60 X de l'eau avec une ouverture numérique (NA) de 1,2 qui a été corrigé pour l'aberration chromatique sur l'ensemble des accordabilité de notre OPO et le faisceau de 1064 nm. Le serrés concentrant générée par la lentille de l'objectif de haute NA permet la génération la plus efficace de signaux cohérents Raman sur l'échelle du micron.
10. Les poutres sont combinées élargie afin de déborder l'arrière-port de l'objectif du microscope. Par débordement à l'arrière de l'objectif du microscope, nous pouvons obtenir les meilleures conditions concentrer et donc la meilleure résolution spatiale dans notre système de microscope.
11. L'objectif de notre microscope est monté sur un stade XYZ piézo qui nous permet d'obtenir des images par le faisceau balaye les poutres à travers l'échantillon, similaire à faisceau de balayage commerciales microscopes confocaux.

2. L'utilisation de trois courts lasers pulsés

L'utilisation de trois résultats à court lasers pulsés dans la production de signaux de plusieurs voitures, à partir du c différentsombinations de deux lasers, ainsi que 3-Color CARS et DR-FWM signaux de la combinaison de ces trois lasers.

1. Les longueurs d'onde des signaux peut mentir spectralement proches les uns des autres. Lorsque les signaux sont rapprochés il peut être difficile de les séparer pour analyse à l'aide fixée filtres passe-bande de longueur d'onde et des miroirs dichroïques. Pour cette raison, nos signaux sont transmis dans un spectromètre imageur (SpectraPro 2300i, Acton Research), qui sert aussi d'monochromateur efficace pour séparer spatialement les signaux de longueurs d'onde différentes.
2. Un miroir électronique actionné retourner dans le spectromètre en position basse envoie le signal à une rétro-éclairé profonde déplétion charge-coupled device (CCD) qui fournit des informations spectroscopiques sur toute la gamme du signal entier et nous permet d'identifier et d'optimiser la cohérence de divers signaux Raman.
3. Pour sélectionner le signal avec lequel nous souhaitons nous tourner simplement l'image de la grille dans le spectromètre, en utilisant le fournisseur dans le contrôle et le logiciel d'acquisition de données (WinSpec, Princeton Instruments), au centre du sommet de l'intérêt sur la caméra CCD et ensuite changer les position du miroir flip rediriger ce signal à un port deuxième sortie à laquelle une avalanche compter de photon unique photodiode (APD) a été attaché.
4. L'objectif est alors raster numérisée et les signaux enregistrés sur l'APD sont utilisés pour générer une image en affichant le taux de comptage de photons pour chaque pixel via le logiciel d'acquisition de données (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlin, Allemagne).
5. Nous répétons cette procédure d'imagerie pour chaque signal désiré Raman cohérent qui nous permet de comparer les signaux pendant le post-traitement.

3. Préparation des échantillons

Afin d'obtenir des images claires et reproductibles certaines précautions doivent être prises dans la préparation de l'échantillon.

1. Les échantillons sont généralement préparés sur ~ 150 microns lamelles de verre épais. Ces lamelles sont suffisamment minces pour permettre l'imagerie haute résolution avec les objectifs NA 1.2 qui sont habituellement utilisés.
2. Piégeage optique d'objets diélectrique peut se produire lorsque la lumière du laser est diffractée par le biais de petits objets transparents. L'utilisation de très ciblé, puissance de crête élevée, courts faisceaux laser pulsé pouvez ensuite faire glisser de petites cellules ou de bactéries le long, résultant en des images floues ou tachées. Afin d'éviter cela, il peut être nécessaire pour immobiliser l'échantillon sur la surface de la lamelle de verre en appliquant d'abord une fine couche de poly-L-lysine par spin-coating.
3. Pour les cellules en culture plats en verre à fond la culture peut être utilisé pour l'imagerie qui permettent, sans avoir à décoller les cellules de leurs plats de culture de cellules de croissance.
4. Pour la démonstration dans cette contribution nous avons d'abord déposer un C. formaldéhyde fixes ver nématode elegans sur une lamelle de verre.
5. Puis ajoutez une goutte de 20 pl solution à 5 M de glucose deutéré au ver. La solution de glucose deutéré donne une signature de fond unique et solide Raman.

4. Analyse des échantillons

Afin de bien profiter de l'effet de l'amélioration doublement résonnant les spectres Raman des deux substances Raman de résonance doit être connue.

1. Une fois l'échantillon est préparé sur la lamelle, il est analysé à l'aide d'un microscope confocal Raman pour obtenir le spectre pertinentes spontanée Raman et d'identifier les pics appropriés.
2. Pour effectuer DR-CARS nous identifions les endroits spectrale du mode d'étirement CH, généralement associés à des lipides, et le mode d'étirement de CD, associée avec le glucose deutéré, à 2845 cm ^-1 et 2121 cm ^-1 respectivement.
3. Coherent Raman est atteint lorsque la différence de fréquence entre les deux lasers correspond à la fréquence d'une vibration moléculaire. En réglant une OPO à 817 nm on sondera les 2845 cm ^-1 en mode CH lorsqu'il est combiné avec le faisceau laser 1064 nm et en réglant l'OPO d'autres à 868 nm, elle permettra de sonder les 2121 cm ^-1 pointe lorsque combiné avec un faisceau de 1064 nm .
4. Par le faisceau balaye l'échantillon sur le microscope CARS nous pouvons maintenant observer trois signaux Raman cohérente d'intérêt. Un signal de sonder les VOITURES CH étirement vibration, une CARS signal de sonder la mode d'étirement de CD, et un signal DR-CARS sonder les deux.
5. Nous sélectionnons chaque pic comme décrit dans la section 2.3 et de prendre une image comme décrit ci-dessus.

5. Traitement d'images

Extraction des informations supplémentaires sur ces trois images exige maintenant des traitements d'image assez simple.

1. D'abord les images doivent être normalisés. Dans la théorie de la normalisation peut être réalisé en tenant compte de l'intensité de chaque laser impliquées dans chaque processus de génération de signal. En pratique, cependant cela ne fonctionne pas toujours, principalement en raison de la non-réponse spectral uniformedes miroirs dichroïques, des détecteurs, et des grilles.
2. Une méthode pratique pour la normalisation repose sur le fait que dans les régions où dominent les lipides purs du signal, la résonance de CD ne devrait pas contribuer à l'un des signaux. De même, dans les régions de la solution de glucose pur de la résonance CH ne devrait pas contribuer à l'un des signaux. Dans cet esprit, nous normalisons l'image DR-CARS et l'image CARS obtenue sur la résonance de CD de la solution de glucose deutéré à une région bien à l'extérieur de la C. elegans qui devrait présenter aucune résonance CH.
3. Puis nous identifions une région dans le ver à l'image de résonance CH-CARS qui est riche en lipides et la normaliser à la région correspondante dans le normalisée DR-CARS image. Pour cette méthode fonctionne correctement, nous supposons que profondément dans cette région pas de glucose deutéré est présent. Cette hypothèse est sûre puisque les lipides sont hydrophobes et ne se mélange pas avec la solution.
4. Maintenant, en soustrayant les normalisée CH-résonant d'image voitures de la normalisation DR-CARS l'image on se retrouve avec seulement le CD-amplifié de résonance du signal.
5. De même en soustrayant les normalisée CD-résonance image de voitures de la normalisation DR-FWM l'image on se retrouve avec juste le CH-résonant signal amplifié.

6. Les résultats représentatifs

Figure 1: Schéma du système de microscopie DR-CARS comme décrit ci-dessus.

Figure 2: image en lumière blanche d'un C. elegans dans une solution de glucose deutéré préparées sur une lamelle de verre et prêt pour l'imagerie.

Figure 3:. Spectre Raman de l'acide oléique modifiés (un acide gras insaturé) qui inclut une modification alcyne (un groupe carbone-carbone triple liaison) Les résonances CH forte à 2845 cm ^-1 et la résonance alcyne à 2100 cm ^-1 sont à la fois bien isolées de la région d'empreintes digitales (la région de pics densément tassées), ce qui les rend idéales pour les marqueurs d'imagerie Raman cohérente.

Figure 4:. Spectre typique des signaux Raman cohérente générée lorsque trois courts-pulsé les lasers sont engagés dans les limites de l'échantillon Les flèches indiquent le processus (es) responsables de chaque signal tel que représenté par les diagrammes d'énergie. Dans les schémas présentés ici flèches en pointillés indiquent les photons du laser et l'OPO et du flèches pleines indiquent le signal résultant. Les lignes solides horizontales indiquent l'énergie de la vibration Raman et donner une représentation visuelle qui, en RD-CARS, en mélangeant les 3 mêmes photons entrée simultanément deux différentes sondes Raman des vibrations.

Figure 5: Résultats typiques de l'imagerie C. elegans ver utilisant DR-voitures et les. La rangée du haut a utilisé les trois signaux indiqués dans la figure 4 à l'image d'un ver dans une solution de glucose deutéré. Dans la deuxième ligne les images ont été convenablement normalisées et dans la troisième rangée de la différence des images ont été produites en soustrayant chacune des images de l'image CARS DR-CARS.

Discussion

Spectroscopie Raman et Raman à base d'imagerie sont des outils puissants émergent dans les sciences bio. Actuellement, cela est particulièrement vrai pour l'in vivo et in vitro d'étude du métabolisme cellulaire et les troubles métaboliques dans le traitement et le stockage des lipides. La plupart des bio-macromolécules contiennent un grand nombre d'analogues, principalement à base de carbone liaisons moléculaires, de sorte que les spectres Raman obtenus à partir de cellules et d'organismes sont généralement une convolution des contributions des lipides, protéines, acides nucléiques, sucres, lipides etc sont relativement faciles d'isoler à partir de ces spectres complexes, en raison de leur tendance à former des gouttelettes denses ou bicouches et parce qu'ils contiennent des chaînes étendu avec un grand nombre de liaisons CH aliphatiques. Notre capacité d'isoler des protéines spécifiques, acides aminés, ARN ou d'ADN dans l'environnement cellulaire complexe est, cependant, très limitée. Cela est particulièrement vrai si ces molécules d'intérêt ne sont présents à des concentrations pM et ci-dessous. Ici, la capacité de la sonde faibles résonances Raman utilisant notre nouvellement introduit DR-CARS technique d'imagerie différence fournit une approche potentiellement puissant pour leur microanalyse chimique et imagerie. Certes, la partie la plus compliquée de ce protocole est de l'alignement et la synchronisation du système laser. Lors du démarrage à partir de zéro, la synchronisation des impulsions, c'est à dire faire en sorte que les impulsions sont superposées dans le temps, malgré les différents chemins qu'ils prennent peut être facilitée par l'utilisation d'un autocorrélateur pouls. Chevauchent fois spatiale et temporelle est atteinte, CARS et DR-CARS signaux doit être facilement détectable. Toutefois, le premier alignement est souvent brut, résultant en des signaux faibles. La meilleure pratique pour aligner ce système est d'abord ainsi générer des signaux faibles et donc d'améliorer la puissance du signal par un léger peaufinage les miroirs le long de chaque trajectoire et ajustant le chevauchement temporel en utilisant les étapes de retard. Bien que les actes du spectromètre / monochromateur comme une chicane très efficace pour la lumière ambiante la plus propre des résultats peut être réalisé par l'exploitation du système avec les lumières de la pièce éteinte et des rideaux ou des tubes de verre pour minimiser de fond introduites par les différentes sources de lumière d'autres (par exemple les écrans d'ordinateur, voyants, voyants, etc.)

Notre configuration particulière utilise un seul comptage de photons d'avalanche photodiode (APD) et des détecteurs corrélées dans le temps de comptage de photons simples (TCSPC) du matériel de détection ^5. Cela nous permet de détecter des signaux extrêmement faibles avec un bruit relativement faible, mais de nombreux groupes ont trouvé des tubes photomultiplicateurs (PMT) avec un gain variable avantageux quand effectuer des mesures similaires. L'avantage de la PMT, c'est qu'ils offrent à gain variable et ont une surface de détection beaucoup plus grande qui peut simplifier l'alignement du détecteur. De plus, notre configuration utilise les stades piézo pour traduire l'objectif afin de parvenir à la numérisation du faisceau. L'avantage de cela est que nous avons la capacité de revenir à n'importe quel endroit dans l'image précédemment numérisée avec un haut degré de précision et de prendre des mesures supplémentaires, y compris les spectres Raman spontanée. D'autres groupes ont été couronnées de succès en utilisant des assemblées miroir de balayage, ou même l'ensemble des unités confocale à balayage comme le système Olympus FluoView, qui propose d'imagerie beaucoup plus rapide mais elle est limitée dans sa capacité à justement revenir à des positions arbitraires dans une image.

Tuning les lasers pour correspondre à la résonance Raman est également une étape critique qui peut exiger une certaine optimisation. Bien que les pics Raman peut être connu dans le pic d'intensité maximale spectrale obtenue à partir DR-voitures et les ne correspond pas nécessairement au maximum du pic Raman spontanée. Cela est dû à l'interférence intrinsèque des signaux générés par mélange à quatre ondes conduisant à un signal de fond non-résonant et des voitures, ce qui fausse les spectres CARS rapport à spectres Raman spontanée. L'emplacement spectral de la crête du signal CARS peut être calculé, mais une approche plus pratique consiste à ajuster les OPO dans plusieurs petites étapes à travers le spectre emplacement prévu de la résonance Raman. Ce processus devrait donner un maximum clair. En fait, pour la plus grande sensibilité du DR-FWM deux résonances doit être accordé à ce maximum.

Un dernier problème potentiel de l'approche DR-CARS doit également être discuté, c'est à dire le signal DR-CARS dépendra d'une distribution homogène de la molécule d'actifs Raman amplifiant. Pour la plupart des objets biologiques, ce qui pourrait bien être la large résonance OH de l'eau, qui est abondante et presque omniprésente. L'eau est, toutefois, exclus de régions hydrophobes avec une cellule, tels que des gouttelettes lipidiques, conduisant une distorsion des signaux obtenus lors de l'utilisation de la résonance de l'eau pour amplifier les modes de lipides. Dans notre exemple, nous avons utilisé une solution de glucose deutéré pour générer un signal facilement détectable et abondants pour notre échantillon biologique. De même, l'eau ou deutéré deutéré Buffe biologiquesrs, tels que le d-HEPES pourraient être utilisés. Dans notre exemple, le lipide gouttelettes dans le C. elegans ont été assez petit pour contenir à la fois toujours, la solution de glucose et de lipides deutérés dans le spot laser focalisé sur notre système. Ceci, cependant, n'est pas généralement vrai. Un exemple particulier serait adipocytes, qui génèrent des gouttelettes lipidiques assez large au sein de leur cytoplasme. Cela signifie, toute expérience réalisée avec la technique du DR-CARS nécessite une préparation minutieuse et des expériences de contrôle pour vérifier les résultats.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
60X water immersion objective	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW
Inverted Microscope	Olympus Corporation	IX-71SIF-3
Pockels Cell	ConOptics	350-160
Picotrain pump Laser	HighQ	IC-1064-10000
Optical Parametric Oscillator	APE	Levante IR
1.5 Glass cover slips	Fisher Scientific	12-545-102 25cm-1
Half-wave plates	Thorlabs Inc.	AHWP05M-980
Polarizing Beam Splitter Cubes	Thorlabs Inc.	PBS052 or PBS053
Spectrometer/Monochromator	Princeton Instruments/Acton	Spectra Pro 2300i
CCD Camera	Princeton Instruments/Acton	PIXIS: 100B
Avalanche Photo Diode	PerkinElmer, Inc.	SPCM-AGR-14-12691
XYZ Piezo Stage	Physik Instruments	P 733-2CL P 721.CDQ	This is a combination of an XY stage and a Z objective holder
Dichroic Mirrors	Semrock	Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25	These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.
Dichroic Mirror	Chroma Technology Corp.	Z830rdc	To combine the different near-infrared laser beams
TCSPC board	PicoQuant	Timeharp 200
Symphotime Imaging Software	PicoQuant
Matlab	Mathworks