Çifte rezonans Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılımı (CARS) Biyolojik Yapıların Diferansiyel Görüntüleme

Özet

Üç tek dalga boyu kısa darbeli lazerler bir arada tutarlı bir anti-Stokes Raman saçılması (CARS) ve iki kat rezonans ARABALAR (DR-CARS) oluşturmak için kullanılır. Bu sinyaller arasındaki fark, aksi takdirde tutarlı Raman sinyalleri algılamak için zor zayıf Raman sikliklerin görüntüleme sağlayan gelişmiş hassasiyet sağlar.

Özet

Tutarlı Raman görüntüleme teknikleri nedeniyle yüksek molekül özgüllüğü ¹ etiket optik görüntüleme sağlamak için söz, son on yılda faaliyet dramatik bir artış gördük . Ancak, bu tekniklerin duyarlılık, Mili molar moleküler konsantrasyonları ^1,2 gerektiren, floresan daha zayıf büyüklükte çok sayıda siparişi. Burada, biz, güçlü ya da bol Raman sikliklerin elde edilen sinyal yükseltme Raman-aktif moleküllerin zayıf ya da düşük konsantrasyonlarda tespit etkinleştirebilirsiniz bir teknik açıklar. Biyolojik örnek kısa atımlı lazerler etkileşim numuneye ilişkin benzersiz kimyasal bilgi taşıyan her biri tutarlı bir Raman saçılma sinyalleri, çeşitli üretir. Tipik olarak, bu sinyaller, örneğin Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılması (CARS), sadece biri diğerleri atılır bir görüntü oluşturmak için kullanılır. Ancak, 3-renk CARS ve dört dalga karıştırma (FWM) dahil olmak üzere bu diğer sinyalleri, toplanan ve CARS sinyal karşılaştırıldığında, aksi halde zor bilgi algılamak için ³ çıkarılan olabilir. Örneğin, iki kat rezonans ARABALAR (DR-CARS) iki rezonans sinyalleri ⁴ arasında yapıcı bir girişim sonucu . Biz göstermek DR-CARS lipidler 2845 cm ^-1 CH gerilmesi titreşim ve bir döteryumlanmış molekül (örneğin döteryumlanmış şekerler, yağ asitleri, vb) 2120 cm ^-1 CD germe titreşim sinyalleri üretmek için gerekli olan üç lazerler ince ayarının nasıl Raman rezonanslar aynı anda iki prob kullanılabilir. Bu koşullar altında, her rezonans, de üretilen problama DR-CARS kombine bir sinyal CARS sinyalleri ek olarak. DR-CARS sinyal ve zayıf sinyal duyarlılığı artırmak için kullanılan bol bir molekülün titreşim yükseltme sinyali arasındaki fark tespit nasıl göstermektedir. Biz bu yaklaşımı biraz daha güçlü bir çözücü Raman sinyal kullanarak örneğin seyreltik çözünen zayıf Raman sinyal artırabilirsiniz böyle iki sinyalleri farklı moleküllerden oluşturulan uygulamalar bile uzattığını gösteriyor.

Protokol

1. ARABALAR ve DR-CARS Sinyalleri Üretimi

ARABALAR oluşturmak ve DR-CARS sinyalleri, aynı anda üç ayarlanabilir ve senkronize kısa darbeli lazer kaynakları gereklidir.

1. Biz tek bir 10 W lazer (PicoTrain, HighQ lazer, Inc.) Ile başlar üç senkronize bakliyat elde etmek için. Bu lazer, 1064 nm sabit bir dalga boyu, 7 ps sabit bir darbe uzunluğu ve 76 MHz sabit bir tekrarlama oranı vardır.
2. Yarım dalga plakaları bir dizi kullanmak ve ışın demeti splitter polarize üç parçaya ayrılır küpler. Polarize ışın ayırıcı küp ile birlikte yarım-dalga plaka demetinin her bir bileşenin yönünü değiştirmeden bize güç miktarını ayarlamak için izin verir. Tipik olarak, iki ışın ~ 4,5 W her ayarlanır ve üçüncü kiriş kalan 1 W. içerir.
3. Iki yüksek güç kirişler daha sonra iki bağımsız optik parametrik osilatörler (OPO, Avante, APE GmbH, Berlin, Almanya) içine yönlendirilir. Farklı dalga boylarında, iki düşük enerjili fotonların bir yüksek enerji foton dönüştürmek OPO kullanımı fark frekansı nesil. Bu etkiyi elde etmek için kullanılan kristal sıcaklığını kontrol ederek, ortaya çıkan fotonların dalga boyları 0,1 nm içinde kontrol edilebilir. By frekans iki katına, bu sinyaller, 1064 nm sabit bir dalga boyuna sahip bir lazer 780 nm ile 910 nm arasında herhangi bir ayarlanabilir bir lazer ışını dönüşebilir. Aynı 1064 nm kaynağı ile iki ayrı OPO pompa, otomatik olarak orijinal pompa lazer senkronize iki bağımsız olarak ayarlanabilir lazer kaynakları edinin.
4. 1064 nm pompa lazer üçüncü (en düşük güç) ışını üç kirişler (2 pompa lazer OPOS, 1) sonra recombined böylece dikroik ayna kombinasyonu ile OPO çevresinde yönlendirilir. Tutarlı Raman sinyal fotonlar verimli üretmek için recombined bakliyat hem zamansal ve mekansal çakışmış olması gerekir. OPO her lazer darbe kristal birden çok kez geçmesine izin veren, halka boşluklar içerdiğinden, OPO seyahat yoluyla gönderilen orijinal pompa ışınına göre önemli bir gecikmeye neden fazladan bir mesafe kirişler. Bu mesafe, dikroik aynalar kullanarak recombined önce bu ışın, diğer iki aynı mesafe seyahat kuvvet ek aynalar getirerek üçüncü ışını ile telafi edilmelidir.
5. Sağlamak amacıyla her bir ışın prizma retroreflektörler kullanarak, ayarlanabilir gecikme aşamalarında yol yolun uzunluğu ince ayarı, her bir ışın yolu tanıtıldı.
6. Yarım dalga plakaları ve polarize ışın ayırıcı küpler başka set, bize bağımsız OPO giriş etkilemeden her ışın güç ayarlamasına olanak sağlamak için her ışın eklenir.
7. Dikroik aynalar, ilk iki OPO ve daha sonra 1064 nm ışın ile gelen kirişler birleştirmek için kullanılır. Kirişlerin tam çakışan (yani collinear ve benzer bir sapma var) sağlamak için gerekli önlemler alınmalıdır. Bu yakın kirişlerin üst üste (bir kaç santimetre içinde) ve uzak (~ 1 m) dikroik ayna karşılaştırarak kontrol edilebilir.
8. Darbeli lazerler kullanarak avantajı, her darbe, hala düşük bir ortalama yoğunluğunu korurken tutarlı Raman sinyaller verimli üretimi için izin veren, örnek bir yüksek tepe enerji olabilir ki. Yüksek ortalama yoğunluğu örnek zarar verebilir. Bu nedenle daha fazla pik enerji ödün vermeden ortalama yoğunluğunu kontrol etmek amacıyla, üç birleşik kirişler, bize bu darbeleri tekrarlama oranını ayarlamak için izin veren bir darbe seçici olarak bir elektro-optik modülatör (Pockel hücre, ConOptics) işleyişi aracılığıyla gönderilir Bizim örnek gelmesi ve bu nedenle ortalama bir yoğunluk.
9. Kombine lazer ışınları daha sonra yüksek bir NA amacı ile bir inverted mikroskop içine birleştirilir. Amaç, genellikle bizim OPO tunability ve 1064 nm ışın aralığında renk sapmalarını giderilmiştir 1.2 (NA) sayısal bir diyafram ile 60 X su objektif lens. Yüksek NA objektif lens tarafından oluşturulan odaklanan sıkı mikron ölçekte tutarlı Raman sinyallerinin en verimli üretimi için izin verir.
10. Kombine kirişler mikroskop objektif arka port aşırı doldurmayın amacıyla genişletilmiştir. Mikroskop objektif geri doldurmayın iyi odaklanarak koşulları elde edebilirsiniz ve bu nedenle bizim mikroskop sistemi iyi mekansal çözünürlükte.
11. Mikroskop objektif lens, bize ticari ışın-tarama konfokal mikroskoplar benzer örnek karşısında kirişler, raster tarama görüntüler elde etmek için izin veren bir XYZ piezo sahne üzerine monte edilmiştir.

2. Üç Kısa Pulsed Lazer Kullanımı

Çeşitli c birçok ARABALAR sinyallerinin üretimi üç kısa atımlı lazerler sonuçları kullanılması,iki lazer yanı sıra 3-Renk CARS ve her üç lazerler birleşimi DR-FWM sinyalleri ombinations.

1. Sinyallerin dalga boyları birbirine yakın Işıksal yalan. Sinyalleri birbirine yakın olduğunda sabit dalga boyu bant geçiren filtreler ve dikroik aynalar kullanılarak analiz için onları ayırmak için zor olabilir. Bu nedenle bizim sinyalleri de mekansal farklı dalga boylarında sinyal ayırmak için verimli bir monokromatör olarak hizmet veren bir görüntüleme spektrometre (SpectraPro 2300i, Acton Araştırma) geçti.
2. Alçaltılmış pozisyonu spektrometre içinde elektronik harekete çevirme ve ayna tüm sinyal aralığında spektroskopik bilgi sağlayan arkadan aydınlatmalı bir derin tükenmesi charge-coupled device (CCD) kamera için sinyal gönderir ve bize çeşitli tutarlı belirlemek ve optimize etmek için izin verir Raman sinyalleri.
3. Resim yapmak istediğiniz sinyali seçmek için biz sadece sonra değişim satıcı tarafından sağlanan kontrol ve merkezi veri toplama yazılımı (WinSpec, Princeton Instruments), CCD kamera faiz tepe kullanarak, ızgara spektrometre içinde döndürün ve bu sinyal tek bir foton sayma çığ foto-diyot (AKB) bağlı olan ikinci bir çıkış portuna yönlendirmek için flip ayna yerleştirin.
4. Objektif lens sonra raster taranır ve AKB kaydedilen sinyalleri veri toplama yazılımı (SymPhoTime, Picoquant GmbH, Berlin, Almanya) ile her bir piksel için foton sayısı oranı göstererek bir görüntü oluşturmak için kullanılır.
5. Biz bize post-processing sırasında sinyalleri karşılaştırmak için izin istenen her tutarlı Raman sinyal için bu görüntüleme işlemi tekrarlayın.

3. Numune Hazırlama

Net, tekrarlanabilir görüntüler elde etmek için bazı bakım numune hazırlama alınmalıdır.

1. Örnekler genellikle ~ 150 mikron kalınlığında cam lamelleri hazırlanmıştır. Bu lamelleri tipik olarak kullanılan 1.2 NA hedefleri ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme için izin verecek kadar ince.
2. Dielektrik cisimlerden Optik yakalama lazer ışığı küçük şeffaf nesneler aracılığıyla Kırınan zaman oluşabilir. Sıkıca odaklanmış, yüksek pik güç kullanımı, kısa darbeli lazer ışınları, bulanık ya da kirli görüntüler boyunca küçük hücreleri veya bakteri sürükleyebilirsiniz. Bunu önlemek için ilk spin kaplama poli-L-lisin ince bir tabaka halinde uygulanarak cam lamel yüzeyinde örnek hareketsiz için gerekli olabilir.
3. Cam alt kültür kaplarına kültür hücreleri için hücre kültürü büyüme yemeklerinden hücreleri ayırmak için gerek kalmadan görüntüleme için izin verdiği kullanılabilir.
4. Bu katkı gösteri için öncelikle bir formaldehit sabit C. depozito elegans nematod solucanı bir cam kapak slip.
5. Sonra bir 20 mcL damlacık solucan 5 M döteryumlanmış glukoz çözeltisi ekleyin. Döteryumlanmış glukoz çözeltisi, benzersiz ve güçlü Raman bir arka plan imza sağlar.

4. Örnek Çözümlemeler

Düzgün bir şekilde iki kat rezonans geliştirme etkisi yararlanmak için Raman hem Raman-rezonans maddelerin bilinmesi gerekir.

1. Bir kez numune ilgili spontan Raman spektrumu elde etmek ve tanımlamak için uygun doruklarına konfokal Raman mikroskobu kullanılarak analiz edilmektedir lamel hazırlanmıştır.
2. 2845 cm ^-1 ve 2121 cm ^-1 sırasıyla, döteryumlanmış glukoz ile ilişkili, genellikle lipidler ile ilişkili CH streç modu, ve CD streç modu spektral yerleri belirlemek DR-CARS gerçekleştirmek için.
3. Tutarlı Raman saçılması bir moleküler titreşim frekansı iki lazer arasındaki frekans farkı eşleştiğinde elde edilir. By ayar bir OPO 817 nm ve 868 nm 1064 nm ışını ile kombine edildiğinde, 2121 ^cm -1 zirve prob diğer OPO ayar 1064 nm lazer ışını ile kombine ^{edildiğinde,} 2845 cm -1 CH modunda prob olacak .
4. Raster tarama, şimdi üç ilgi tutarlı Raman sinyalleri izleyebilirsiniz CARS mikroskop örnek. A CARS titreşim uzanan CH problama sinyal, CARS CD streç modu ve hem de problama DR-CARS sinyal problama sinyali.
5. Bölüm 2.3 'de açıklandığı gibi, her tepe seçin ve yukarıda açıklandığı gibi bir görüntü çekmek.

5. Görüntü İşleme

Bu üç resim dayalı ek bilgi ayıklanıyor şimdi bazı oldukça basit bir görüntü işleme gerektirir.

1. İlk görüntüler normalize edilmelidir. Her bir sinyal üretim sürecine katılan her lazer yoğunluğu için muhasebe teorisi normalleşme sağlanabilir. Ancak uygulamada bu her zaman düzgün olmayan spektral tepki nedeniyle ağırlıklı olarak, iş değildirdikroik aynalar, dedektörler ve ızgaralar.
2. Normalleşmesi için pratik bir yöntem saf lipidler sinyal hakim bölgelerde, CD rezonans sinyali herhangi bir katkıda bulunmaz gerektiği gerçeğine dayanır. Aynı şekilde, saf glukoz çözeltisi bölgelerde CH rezonans sinyali herhangi bir katkıda olmamalıdır. Bunu akılda tutarak, C. dışında bir bölgeye döteryumlanmış glukoz çözeltisi CD rezonans elde DR-CARS görüntü ve CARS görüntü normale elegans solucan hiçbir CH rezonans göstermelidir.
3. Sonra lipidler açısından zengin olan CH-rezonans CARS görüntü solucan içinde bir bölge belirlemek ve normalize DR-CARS görüntü içinde ilgili bölge normalleştirmek. Bu yöntem düzgün çalışması için biz bu bölgede derin döteryumlanmış glikoz mevcut olduğunu varsayalım. Hidrofobik lipidler ve çözümü ile karıştırmayın, çünkü bu güvenli bir varsayım.
4. Şimdi, normalize DR-CARS görüntü normalize CH-rezonans CARS görüntü çıkarılarak, sadece CD-rezonans sinyal amplifiye sol.
5. Benzer şekilde normalize DR-FWM görüntü normalize CD-rezonans CARS görüntü çıkarılarak sadece amplifiye CH-rezonans sinyali ile bırakılır.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1: Yukarıda da açıklandığı gibi DR-CARS mikroskopi sistemi diyagramı .

Şekil 2: C. Beyaz ışık görüntü döteryumlanmış glukoz çözeltisi elegans solucan bir cam lamel hazırlanmış ve görüntüleme için hazır.

Şekil 3: bir alkin değişiklik (karbon üçlü bağı karbon grubu) içeren modifiye oleik asit (doymamış yağ asidi) Raman spektrumu 2845 cm ^-1 ve 2100 cm alkin rezonans güçlü CH rezonanslar ^-1 her ikisi de tutarlı Raman görüntüleme için ideal belirteçleri, parmak izi bölgesi (yoğun paketlenmiş doruklarına bölge) izole edilmiştir.

Şekil 4: Tipik örnek içinde çakışan üç kısa darbeli lazerler zaman tutarlı Raman sinyallerinin spektrum oklar enerji diyagramları ile temsil gibi, her bir sinyal için sorumlu süreç (ler) işaret etmektedir . Burada gösterilen diyagramlar kesik oklar ortaya çıkan sinyali gösteren fotonlar lazer ve OPO ve katı oklar göstermektedir. Katı yatay çizgiler Raman titreşim enerjisini gösterir ve DR-CARS, probları aynı anda iki farklı Raman titreşimler aynı 3 giriş fotonlar karıştırma, görsel bir temsil vermek.

Şekil 5: Tipik görüntüleme C. sonuçları DR-CARS ve CARS kullanarak elegans solucanlar üst satırındaki döteryumlanmış glikoz bir çözüm görüntü bir solucan Şekil 4'te belirtilen üç sinyal kullanılır. İkinci satırda görüntüleri uygun şekilde normalize edildi ve üçüncü sıra farkı görüntüler DR-CARS görüntü her CARS görüntüler çıkarılarak tarafından üretildi.

Tartışmalar

Raman spektroskopisi ve Raman tabanlı görüntüleme biyolojik bilimler alanında güçlü gelişmekte olan araçlardır. Şu anda, bu in vivo ve in vitro çalışma Lipidlerin işleme ve depolama hücre metabolizması ve metabolik bozukluklar için özellikle doğrudur. En biyo-makromoleküller hücreleri ve organizmalardan elde edilen Raman genellikle yağlar, proteinler, nükleik asitler, şekerler katkıları konvolüsyon böylece benzer, çoğunlukla karbon bazlı moleküler bağlar çok sayıda içeren, vb Lipidler nispeten kolaydır çünkü yoğun damlacıkları veya bilayers formu kendi eğilim ve alifatik CH bağlarının çok sayıda uzun zincirler içerdiğinden, bu karmaşık spektrumları izole etmek. Ancak, karmaşık hücresel ortamı içinde, özel proteinler, amino asitler, RNA veya DNA izole etmek için yeteneği çok sınırlıdır. Ilgi, bu moleküllerin aşağıda sadece mcM konsantrasyonlarda, bu özellikle doğrudur. Burada, yeni sunulan DR-CARS fark görüntüleme tekniği kullanan zayıf Raman rezonanslar prob yeteneği kimyasal mikro ve görüntüleme için bir potansiyel olarak güçlü bir yaklaşım sağlar. Kuşkusuz, bu protokolün en karmaşık kısmı lazer sistemi ile uyum ve senkronizasyon. Sıfırdan başlarken, bakliyat senkronizasyon, yani, bakliyat, bir darbe autocorrelator kolaylaştırılabilir alan farklı yollar rağmen zaman çakışan sağlamak. Bir kere mekansal ve zamansal örtüşmesi durumunda, elde CARS ve DR-CARS sinyalleri kolayca algılanabilir olmalıdır. Ancak, ilk hizalama zayıf sinyaller sonucu, sık sık ham budur. Bu sistem iyi hizalamak için en iyi uygulama, başlangıçta zayıf sinyaller oluşturmak ve daha sonra yavaşça her yol boyunca verdiği aynalar ve gecikme aşamaları kullanarak temporal örtüşme ayarlayarak sinyal gücünü artırmak için. , Oda ışığında için çok etkili bir baffle olarak temiz oda ışıkları ile işletim sistemi ile elde edilebilir spektrometre / monokromatör eylemleri kapalı ve perde veya lens tüp çeşitli diğer ışık kaynaklarının (örneğin bilgisayar monitörleri tarafından tanıtılan arka plan en aza indirmek için rağmen gösterge ışıkları, LED, vb.)

Bizim özellikle kurulum, tek foton sayma çığ foto-diyot (AKB) dedektörleri ve ^{algılama 5} için zaman korelasyon tek foton sayma (TCSPC) donanım kullanır . Bu bize son derece zayıf sinyalleri algılamak için nispeten düşük gürültü ama birçok grup benzer ölçümleri yapmak avantajlı değişken kazanç ile foto çoğaltıcı tüpler (PMT) bulduk sağlar. PMT avantajı değişken kazanç sunuyoruz ve dedektör Hatların çok daha büyük bir algılama alanı vardır. Ayrıca, kurulum ışını tarama ulaşmak için objektif çevirmek için piezo aşamaları kullanır. Bunun avantajı, yüksek bir doğruluk derecesi ile Önceden taranmış bir görüntüyü içinde herhangi bir noktaya dönmek ve spontan Raman dahil ek ölçümler almak yeteneğine sahip olmasıdır. Diğer gruplar tarama ayna meclisleri, ya da böyle çok daha hızlı görüntüleme sunar ama tam bir görüntü içinde keyfi yerlere dönmek için yeteneği sınırlı Olympus FluoView sistemi, hatta tüm konfokal tarama birimleri kullanılarak başarılı olmuştur.

Raman rezonans da, bazı optimizasyon isteyebilir kritik bir adımdır maç lazerler Tuning. Raman doruklarına DR-CARS ve CARS elde edilen maksimum spektral tepe yoğunluğu bilinen olabilir, ancak mutlaka kendiliğinden Raman tepe maksimum karşılık gelmiyor. Bu göreceli CARS spontan Raman spektrumları bozan olmayan bir rezonans arka plan sinyal ve CARS, giden dört-dalga karıştırma tarafından üretilen sinyallerin içsel girişime nedeniyle. CARS sinyalinin tepe spektral konumu hesaplanır, ancak daha pratik bir yaklaşım Raman rezonans beklenen konuma çapında birçok küçük spektral adımda OPOS ayarlamak için olabilir. Bu sürecin net bir maksimum verim gerekir. Aslında, hem rezonanslar DR-FWM büyük hassasiyet için maksimum ayarlanmış olmalıdır.

DR-CARS yaklaşımın son bir potansiyel sorunu da ele alınacak, yani DR-CARS sinyal Raman aktif yükseltme molekülünün homojen bir dağılım bağlıdır. Çoğu biyolojik nesneler için, bu iyi, bol ve neredeyse her yerde hazır ve nazır geniş su OH rezonans olabilir. Su Ancak, lipid modları güçlendirmek için su rezonans kullanılarak elde edilen sinyallerin bir bozulma önde gelen lipid damlacıkları gibi bir hücre ile hidrofobik bölgeler, dışında. Bizim örneğimizde, kolayca algılanabilir ve bol miktarda biyolojik örnek bir sinyal oluşturmak için döteryumlanmış glikoz solüsyonu kullanılabilir. Benzer şekilde, su Dötöro veya biyolojik Buffe döteryumlanmışrs, d-Hepes olarak kullanılabilir. Bizim örneğimizde, C. içinde lipid damlacıkları elegans solucan, her zaman sistem odaklı lazer nokta içinde, döteryumlanmış glukoz çözeltisi ve lipidler hem de içeren kadar küçük. Ancak bu, genellikle doğru değildir. Belirli bir örnek adipositler, kendi sitoplazma içinde oldukça geniş lipid damlacıkları oluşturmak olacaktır. Bu demektir ki, DR-CARS tekniği ile yapılan herhangi bir deney sonuçları doğrulamak için, dikkatli bir hazırlık ve kontrol deneyleri gerektirir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
60X water immersion objective	Olympus Corporation	UPLSAPO 60XW
Inverted Microscope	Olympus Corporation	IX-71SIF-3
Pockels Cell	ConOptics	350-160
Picotrain pump Laser	HighQ	IC-1064-10000
Optical Parametric Oscillator	APE	Levante IR
1.5 Glass cover slips	Fisher Scientific	12-545-102 25cm-1
Half-wave plates	Thorlabs Inc.	AHWP05M-980
Polarizing Beam Splitter Cubes	Thorlabs Inc.	PBS052 or PBS053
Spectrometer/Monochromator	Princeton Instruments/Acton	Spectra Pro 2300i
CCD Camera	Princeton Instruments/Acton	PIXIS: 100B
Avalanche Photo Diode	PerkinElmer, Inc.	SPCM-AGR-14-12691
XYZ Piezo Stage	Physik Instruments	P 733-2CL P 721.CDQ	This is a combination of an XY stage and a Z objective holder
Dichroic Mirrors	Semrock	Ff01-720/SP-25 LPD01-633RS-25	These specific dichroics are not critical, any set with the appropriate transmission/reflection characteristics will be sufficient.
Dichroic Mirror	Chroma Technology Corp.	Z830rdc	To combine the different near-infrared laser beams
TCSPC board	PicoQuant	Timeharp 200
Symphotime Imaging Software	PicoQuant
Matlab	Mathworks