מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

Summary

שיטות באמצעות מערכות alphavirus transducing להביע כתבים פלורסנט במבחנה יתושים בוגרים מתוארים. טכניקה זו עשויה להיות מותאם כדי להביע כל חלבון של עניין במקום או בנוסף לכתב.

Abstract

Alphavirus מערכות transducing (ATSs) הם כלי חשוב לביטוי גנים עניין (GOI) במהלך ההדבקה. ATSs נגזרות שיבוטים cDNA של יתושים וירוסים RNA (Alphavirus הסוג; משפחה Togaviridae). הסוג Alphavirus מכיל כ 30 שונים יתושים מינים וירוס. Alphaviruses הם נגיפים עטופים ומכילים חד גדילי RNA בגנום (~ 11.7 Kb). Alphaviruses לתמלל subgenomic mRNA המקודד חלבונים מבניים של הנגיף נדרש encapsidation של הגנום והתבגרות של הנגיף. Alphaviruses הם בדרך כלל ממס ביותר בתאים בעלי חוליות, אך בהתמדה להדביק תאים רגישים יתוש עם cytopathology מינימלית. תכונות אלו הופכות אותם כלי מעולה עבור ביטוי גנים וקטורים יתושים. ATSs הנפוץ ביותר בשימוש נגזרות Sindbis וירוס (SINV). כמיהות מינים רחב של SINV מאפשר הדבקה של cells8 חרקים, העופות, היונקים. עם זאת, ATSs כבר נגזר alphaviruses אחרים, כמו גם ^9,10,20. ביטוי גנים זרים מתאפשרת על ידי החדרה של אתר נוסף נגיפי RNA חניכה subgenomic או האמרגן. ATSs שבו רצף הגן אקסוגניים ממוקם 5 "לגנים מבניים ויראלי משמש ביטוי חלבון יציב חרקים. ATSs, שבו רצף הגן ממוקם 3 "לגנים מבניים, משמש להפעלת RNAi ושתיקה הביטוי של הגן כי החרק.

ATSs הוכיחו להיות כלי חשוב להבנת וקטור הפתוגן אינטראקציות, פרטים המולקולרי של שכפול נגיפי מחזורי תחזוקה זיהומיות ^{3,4,11,19,21.} בפרט, את הביטוי של עיתונאים פלורסנט bioluminescent כבר סייעה מעקב אחר זיהום ויראלי בשידור וקטור הווירוס ^5,14-16,18. בנוסף, התגובה החיסונית וקטור תוארה באמצעות שני זנים של SINV שהונדסו GFP ^2,9.

כאן, אנו מציגים שיטה לייצור SINV ובו כתב ניאון (GFP) מ שיבוט cDNA זיהומיות. זיהומיות, באורך מלא RNA הוא עיבד מ שיבוט cDNA לינארית. זיהומיות RNA מוחדר לתאים יעד מתירני ידי electroporation. תאים transfected ליצור חלקיקי נגיף מדבק המבטא את GOI. וירוס שנקטפו משמש להדביק יתושים, כפי שתואר כאן, או לארח מינים אחרים (לא מוצג כאן). יכולת וקטור נבחנת על ידי גילוי הקרינה מחוץ midgut או על ידי ניטור הנגיף ⁷ הילוכים. שימוש עיתונאי ניאון כמו GOI מאפשר אמידה נוח להתפשטות הנגיף ברחבי התרבות תאים, לצורך קביעת שיעור הפצת הזיהום, על יתושים חשוף, העברת הנגיף היתוש ומספק מד מהירה של יכולת וקטור.

Protocol

הפרוטוקול הבא נכתב לייצור ושימוש ATS מבוסס על נגיף Sindbis MRE16. ATS נועד לבטא את ה-GFP Aedes וקטור יתוש aegypti. שיבוטים זיהומיות cDNA של מספר alphaviruses (וירוס Sindbis, Chikungunya וירוס, O'nyong-ניונג וירוסים, סוסים המערבי וירוס דלקת קרום המוח) זמינים כעת אשר עוצבו כמו של ATS (טבלה 1). לקבלת התוצאות הטובות ביותר פלסמיד דנ"א מוגבר של חיידקים כגון חיידקים המוסמכת בטוח (Stratagene / Agilent Technologies), כדי למנוע רקומבינציה לא רצויות הפסד של cDNA ויראלי. כל פלסמידים שיבוט זיהומיות יש T7 bacteriophage או SP6 האמרגן ב 5 מיידית "בסופו של cDNA ויראלי עבור שעתוק של RNA באורך מלא גנומי endonuclease הגבלה ייחודי על 3" בסופו של שעתוק נגר. עבור כל ATS, המשתמשים חייבים להשתמש bacteriophage המתאים DNA פולימראז תלוי רנ"א endonuclease הגבלה ייחודית של שעתוק במבחנה של הגנום רנ"א נגיפי.

1. הדור של רנ"א זיהומיות של שיבוט cDNA.

1. Linearize 5μg של המשובט זיהומיות פלסמיד (p5'dsMRE16 / GFP) עם 20 יחידות של אנזים הגבלה XhoI בתגובה 100 μL. דגירה עבור 2-3h ב 37 ° C
2. לטהר DNA לינארית באמצעות Qiagen QIAprep ספין Miniprep פרוטוקול ערכת טיהור חלופי, משחררי DNA מהעמודה ספין באמצעות מים 50 μL RNase חינם. ריכוז פלסמיד צריך להיות כ 1.0 מיקרוגרם / μL.
3. בתוך צינור RNase ללא 0.2 PCR מ"ל, הגדרת תגובה 50 שעתוק μL באמצעות ערכת Ambion MAXIscript לכל פרוטוקול כדלקמן.
   
   • 22.5 μL RNase ללא DH ₂ O
     • 5.0 תבנית μL DNA לינארית (1.0 מיקרוגרם / μL)
     • 2.5 μL 10mm ATP
     • 2.5 μL 10mm CTP
     • 2.5 μL 10mm UTP
     • 2.5 μL 1mm GTP
     • 2.5 μL 10mm כובע אנלוגי (מ ⁷ G (5 ') ppp (5') G)
     • 5.0 μL שעתוק 10X חיץ
     • 5.0 T7 μL או SP6 לערבב פולימראז
   • סך הכל 50.0 μL
4. דגירה התגובה שעתוק עבור שעה 1 ב 37 ° C. לאחר דגירה, התגובה יש להשתמש מיד electroporation של BHK-21 תאים. הכנת BHK-21 תאים electroporation צריך להתחיל במהלך התגובה שעתוק הדגירה.

2. הדור של וירוס מ-RNA זיהומיות

1. Trypsinize two 70-80% ומחוברות 150 ס"מ ² (T-150) BHK-21 הבקבוקון תאים לכל ATS.
2. העברת כל התאים לצינור מ"ל 15 צנטריפוגות חרוטי.
3. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 2000 סל"ד, 10 דק ', 4 ° C בצנטריפוגה השולחן קונבנציונאלי.
4. תאים Resuspend ב PBS סטרילי ללא Mg + + ו-Ca + +. חזור על שלבים 2.3 ו - 2.4 עד תאים נשטפו שלוש פעמים עם PBS.
5. Resuspend התאים pelleted 0.5 ממ מ"ל המכיל 10% FBS.
6. מדולל 10 תאים μL עם 90 ממ μL עם 10% ו FBS לסמוך hemacytometer. אם יש צורך, התאים כדי לדלל 2.5-12.5 ⁷ x 10 תאים / מ"ל עם מזכרות המכיל 10% FBS.
7. כדי קובט קרים כקרח 0.2 ס"מ electroporation, להוסיף 400 ההשעיה תא μL ו 20 תגובה שעתוק μL. נגב עיבוי מ קובט.
8. דופק קובט פעמיים: 450V, 1200Ω, 150 μF. אנו משתמשים Manipulator תא אלקטרו, הרווארד Apparatus דגם ECM630.
9. מניחים את כל התוכן של קובט לתוך הבקבוק 25 ² ס"מ בתרבית רקמה המכילה 5 ממ מ"ל עם 10% FBS.
10. בקבוק דגירה (ים) ב 37C עם 5% CO _2.
11. צג את הזיהום יומי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה עם סט פילטר מתאים (למשל GFP מסנן: גל עירור = 460-490 ננומטר, פליטת גל = 510-550 ננומטר, או dsRed מסנן: גל עירור = 460-560 ננומטר, פליטת גל => 590 ננומטר).
12. כאשר הקרינה עולה זיהום ומחוברות ו / או CPE גלוי בכל בקבוק, לאסוף את תכולת הבקבוק, להוסיף 30% FBS, aliquot לפי הצורך, ולאחסן ב -80 ° C. אם תרצה, lysates תא עשויה להיות מסומנת על ידי צנטריפוגה (2,000 סל"ד, 10 דק ', 4 ° C) לפני תוספת של FBS.
13. מעבר וירוס לפחות פעם אחת באמצעות בקבוק חדש של תאים כדי להגדיל את titer וירוס עבור מבחני האכלה דם עוקבות.

3. Per os זיהום של יתושים

1. מערבבים יחד דם (שנרכש בדרך כלל דה fibrinated דם כבשים) ו תרבית תאים ההשעיה וירוס נגזר שלב 2.13. Titer וירוס גמר הארוחה דם בדרך כלל יש ~ 1x10 ⁷ יחידות פלאק ויוצרים (pfu) / mL לזיהום midgut יעיל של היתוש. כדי לעורר יתושים להצטבר, אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP) ניתן להוסיף בריכוז הסופי של 0.02M.
2. יתושים עשויהצריך להיות משולל מים וסוכר לפני זיהום לגרות אותם כדי להאכיל את הדם ביעילות ממזין מלאכותי. משך זמן של קיפוח יש להקים קודם לכן כדי למזער את התמותה. טיימס יהיה תלוי מין יתושים, לחות וכו 'insectary כנקודת מוצא, להסיר 24h סוכר במים 12 שעות לפני ההזנה. פרוטוקול זה משתמש במים במעיל feeders17 זכוכית עם מים במחזור 37 ° C. קרום המעי חזירי (כלומר, שטף ביסודיות נקניק מעטפת זמין בחנויות מכולת ביותר) ממוקם על הפה של מזין ואת הארוחה pipetted לתוך החדר. עיצובים שונים, ממברנות ופרוטוקולים זמינים עבור סוגים שונים וקטור.
3. יתושים ממוינות לבחור רק יתושים צבה עם דם. יתושים צבה מועברים קרטון עם האורגנדי על גבי ועל יתושים מודגרת ב 28 ° C, לחות יחסית של 75-80% עד מעובד ביטוי של GFP.

4. הרכבת חיסון Intrathoracic של יתושים

חיסון Intrathoracic היא שיטה חלופית עבור הדבקה של arthropod. שיטה זו משמשת כאשר הפצת דרך midgut אינה נדרשת. (שיטה המתוארת להלן, אך הטכניקה אינה מוצגת בניסוי הזה חזותי).

1. מספר קטן של יתושים (50-10) היא aspirated מן הכלובים מחזיק לתוך צינורות הפלסטיק מחזיק. צינורות מחזיקה אטום יוצב על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לצנן את היתושים.
2. 2 5 יתושים יישפך מהצינור על צלחת זכוכית שהיתה מונחת על קרח. מניחים את המכסה על צלחת פטרי כאשר אינו בשימוש, או אם יתושים להתחיל לנוע. במהלך הטיפול של יתושים, יש להקפיד לספור ולעקוב אחר מספר היתושים להיות מניפולציות. כמו יתושים הם נשפך על השולחן צמרמורת, המספר הכולל תירשם על הדלפק מעבדה.
3. מחט הוא הוכן על ידי התכה באמצעות צינור נימי זכוכית Nanoject ספציפיים חולץ מחט.
4. ההתקנה השנייה Nanoject microinjector לכל הוראות היצרן עבור משלוח של 69 NL inoculum. הטיפול חייב להיות מופעלים כאשר הציור inoculum לתוך המחט כך את המחט אינו פגום.
5. באמצעות מיקרוסקופ לנתח, הכנס את המחט לתוך בית החזה של היתוש ולהפעיל את Nanoject עבור חיסון. הטיפול חייב להיות מופעלים כאשר inoculating יתושים כך המחט לא לגמרי לחדור יתושים ולצאת מהצד השני, מה שגרם למותם הבאות של היתוש. בדוק כל יתוש כדי להיות בטוח כי inoculum נכנסו לפני הסרת אותה המחט.
6. לאחר חיסון, בעוד היתושים הוא עדיין משופדת על המחט, למקם אותו קרטון נייר מחזיק דרך חור קטן בצד זה מחובר עם כותנה או פקק השעם בכל עת אחרים.
7. כאשר היתושים יש מחוסן ו להציב לתוך קרטון (עד כ 50 לכל קרטון), בזהירות קלטת את הפקק במקום כדי למנוע שחרור מקרית של היתושים. מניחים את קרטונים לפח מחזיק מאובטח לפני הדגירה נוספת insectary ב 28 ° C ו 80% לחות יחסית.

5. ניטור זיהום של יתושים

1. מניחים את קרטון נייר מחזיק ב 4 מעלות צלזיוס למשך כ 15 דקות כדי לשתק יתושים.
2. העברת מספר קטן של יתושים (50-10 בכל פעם) אל שולחן צמרמורת מותאם לשימוש על מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
3. בדוק ולמיין יתושים מבוסס על נוכחות או העדר פלואורסצנטי. בנוסף, עוצמת פלורסנט יכול לשמש מדידה כמותית proxy של זיהום. רקמות כמו יתוש midguts, בלוטות הרוק, שומן הגוף יכול להיות גזור ומנוטרים עבור פלואורסצנטי.
4. במידת הצורך, לחזור יתושים שנבחרו קרטון נייר להמשיך דגירה של יתושים נגועים.

6. הילוכים Assay (ריור נאלץ להפגין הילוכים וירוס)

1. לשלול יתושים של מקור סוכר 24 שעות לפני ההזנה.
2. הסר רגליים וכנפיים
3. כדי צינור 50 נימי μL כי כבר מחומם, משך וגזרה בקצה אחד, להוסיף 3-5 μL שמן Cargille טבילה סוג B או 10% סוכרוז בסרום-פתרון.
4. הכנס את חוטם לתוך הצינור. אם משתמשים בשמן, טיפות של רוק יראו להפריש מן חוטם. אחת μL של פתרון pilocarbine 1% לבין 0.1% PBS Tween 80 יכול להיות מיושם על בית החזה כדי לעורר.
5. אחרי 60-90 דקות להסיר יתושים חנות לבידוד הנגיף אם נדרש.
6. הסר את הפתרון של הצינור על ידי צנטריפוגה בתוך שפופרת המכילה 100% μL 20 FBS-PBS.
7. סינון סטרילי inoculum דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר ולאחר מכן השתמש סינון inoculum להדביק תאים בתרבית.

הערה biosafety: פרוטוקול זה מתארשיטה להפקת, זיהוי, ניטור יתושים נגועים. בהתבסס על מתקני שלך (כלומר שולחן צמרמורת, מתקן בלימה וכו ') לאישור IBC, אתה עלול להיות מוגבל לבחון אותם רק לאחר הסרת כנפיים ורגליים כדי למנוע בריחה. SINV מבוססי ATS זה יכול להיות שנוצר בשימוש בסביבה BSL2. השימוש ATS מבוססת על alphaviruses אחרים כגון Chikungunya וירוס וירוסים או סוסים המערבי דלקת המוח ידרוש BSL3 מתקנים.

7. נציג תוצאות

סקירה של הביטוי של הגן סמן (GFP) באמצעות 5'dsMRE16 ATS / GFP מוצג באיור 1. הביטוי של ה-GFP ב BHK-21 ו C6/36 (Aedes albopictus) תאים מוצג באיור 2 בזמנים מסוימים של תאים לאחר ההדבקה בווירוס 5'dsMRE16 / GFP על ריבוי 0.01 של זיהום. איור 3 הוא סקירה של זיהום בנגיף alphavirus ו-ATS של היתוש כאשר הנגיף מועבר דרך ארוחה דם זיהומיות. איור 4 מראה הכנת ארוחה דם עם ⁷ ~ 10 pfu / mL של הנגיף ATS ואחריו זיהום אוראלי של Aedes aegypti. הגוף השקפה שלמה של יתושים נגועים בכל חלקי גוף נבחרים זיהום 10 ימים הודעה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence (איור 5). גילוי ה-GFP ו dsRED ב midguts של יתושים נגועים הבאים זיהום עם וירוסים ATS 5'dsMRE16 להביע כל הגן סמן פלואורסצנטי (איור 6). Assay הילוכים באמצעות יתושים נגועים עם 5'dsMRE16 / GFP ATS וירוס (איור 7).

טבלה 1. ATS של מהונדסים כיום ביטוי גנים יתושים.

Alphavirus	ATS	יתוש	הפניה
Sindbis וירוס	TE / 3'2J ו TE / 5'2J	Aedes aegypti	12
		Ochlerotatus triseriatus	13
	3'dsMRE16 ו 5'dsMRE16	א aegypti	5
		Culex tritaeniorhynchus	5
	5'dsTR339	א AEG ypti	2
Chikungunya וירוס	3'dsCHIKV ו 5'dsCHIKV	א aegypti / A. albopictus	20
O'nyong ניונג וירוס	5'dsONNV	אנופלס gambiae	1,9
המערב סוסים וירוס דלקת קרום המוח	5'dsWEEV. מקמילן	Culex tarsalis	Stauft et al., לא פורסם

טבלה 2. יתרונות / חסרונות של שימוש של ATS על ביטוי גנים יתושים.

יתרונות:

הפקה מהירה של הנגיף גבוהה titer

מארח מגוון רחב (SINV)

שיעור גבוה שכפול רנ"א

רמות גבוהות ביטוי transgene

הקלות היחסית של גנים מניפולציה

גן יציבה, הבעת המתמשכת חרקים

פתולוגיה מינימלי חרקים

חסרונות:

לטווח קצר ביטוי במצב בתאים בעלי חוליות

תופעות cytopathic חזקה על תאים החולייתנים

גודל ג'ין הגבלות (<1Kb, באופן אידיאלי)

Alphaviruses מסוימים דורשים BSL3 הבלימה

איור 1: סקירה כללית של ייצור וירוס ATS ב BHK-21 תאים באמצעות p5'dsMRE / GFP GFP SINV להביע. בעקבות ב שעתוק במבחנה, גנומית ATS RNA הוא electroporated BHK-21 לתוך התאים בהם הוירוס הוא הציל. הווירוס ATS לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להדביק יתושים. SGP = subgenomic האמרגן. שלושה מינים ATS RNA מתועתקים ב cells, הגנום, subgenomic 1 ו 2 subgenomic RNAs. C (capsid), גליקופרוטאינים E2 ו-E1 הם התאספו עם ATS הגנום ליצור וירוס מדבק.

איור 2: ביטוי של GFP ב יתושים (C6/36) התאים הבאים זיהום בווירוס 5'dsMRE16 / GFP SINV.

איור 3: מבט כולל על זיהום וירוס ATS ב יתושים מוביל להעברת הנגיף.

איור 4: ATS SINV 5'dsMRE16 זיהום על ידי חשיפת יתושים לארוחה דם זיהומיות.

איור 5: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP זיהום ב זיהום בימים שלאחר 10. איתור כל הגוף של ה-GFP מראה כי וירוס ברח midgut והופץ לרקמות משנית. איור מראה גם ביטוי של GFP חלקי גוף נבחרים, גם מעיד על זיהום המופץ.

איור 6: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP 5'dsMRE16 ו / הזיהום dsRED של midguts בזמנים מסוימים שלאחר זיהום. Midguts בדרך כלל מוקדים שונים של זיהום מוקדם לאחר צריכת ארוחה המכילה דם וירוס שמתפשט ברחבי midgut האחורי בזמנים מאוחר לאחר הפגיעה.

איור 7: זיהוי ATS 5'dsMRE16 / GFP ברוק היתוש מוקדם ככל זיהום ימים 8 פוסט. Assay נועדה להציג העברת הנגיף ATS מראה כי וירוס 5'dsMRE16 / GFP יכול לבטא את ה-GFP ביציבות לאורך כל תקופת הדגירה של היתוש חיצונית. הלוח השמאלי מציג יתוש ריר לתוך צינור נימי, הלוח מראה מרכז C6/36 תאים נגועים עם הרוק ביום 1 ו - 3 ימים פאנל הזכות לפרסם זיהום.

Discussion

השיטות שהוצגו כאן לאפשר לחוקרים לעקוב אחר זיהום של alphavirus בתרבות התא יתושים היתוש נקבה בוגרת. היתרונות והחסרונות של השימוש וירוסים ATS מסוכמים בטבלה 2. שיבוט ATS זיהומיות ניתן להשפיע גנטית כדי לבטא כל GOI ולא היה בהם כדי להביע נוגדנים שרשרת אחת, מדכאי של RNAi, RNAs antisense מיקוד גנים אנדוגניים, ופרו חלבונים אפופטוטיים. אם עיתונאי אינו בשימוש, הרי חלק הדמיה של שיטה זו אינה רלוונטית. עם זאת, רבים של הפרוטוקולים זהה הכרחיים להצלת וירוס ATS, התפשטות, זיהום יתושים. ישנן מגבלות בגודל מקסימלי של transgene כאשר מוכנס לתוך מערכת transducing alphavirus. מגבלות גודל משתנים בהתאם לזן ההורים השתמשו כדי ליצור את ATS, אבל הם בדרך כלל על 1kb למרות הגנים הכתב גדול כמו גחלילית בלוציפראז שימשו בבניית ATS לשימוש יתושים. מעבדות מחקר עם סכום צנוע של רקע וירולוגיה אמור להיות מסוגל להשתמש ATS הבא של הפרוטוקולים הללו. מספר מעבדות מחקר עשית זאת באמצעות SINV מבוססי של ATS.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
MAXIscript Kit	Ambion	AB1312	Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct.
Cap Analogue (m7G(5’)ppp(5’)G)	Ambion	AM8050
Nanoject II nanoliter injector	Drummond Scientific	3-000-204
Electro Cell Manipulator	Harvard Apparatus	ECM 630