Sistema de alfavirus Transducción: Herramientas para la Visualización de la infección en los mosquitos vectores

Resumen

Métodos para utilizar los sistemas de transducción de alfavirus para expresar a los periodistas fluorescente in vitro y en los mosquitos adultos se describen. Esta técnica puede ser adaptada a expresar la proteína de interés en lugar de o además de un periodista.

Resumen

Alfavirus sistemas de transducción (ATS) son herramientas importantes para la expresión de genes de interés (GOI) durante la infección. Los ATS se derivan de los clones de cDNA de virus transmitidos por mosquitos del ARN (Alphavirus género, familia Togaviridae). El género alfavirus contiene alrededor de 30 diferentes especies de mosquitos del virus. Alfavirus son virus envueltos y contienen una sola cadena genomas de ARN (~ 11,7 Kb). Alfavirus transcribe un mRNA subgenómico que codifica las proteínas estructurales del virus necesarias para la encapsidación del genoma y la maduración del virus. Alfavirus suelen ser muy lítico en las células de vertebrados, pero persistentemente infectar a las células susceptibles de mosquitos con un mínimo de citopatología. Estos atributos los hacen excelentes herramientas para la expresión del gen en los mosquitos vectores. El ATS más común en uso se derivan de virus Sindbis (SINV). El tropismo gama de especies SINV permite la infección de insectos, aves, mamíferos y cells8. Sin embargo, los ATS se han derivado de alfavirus otras ^9,10,20. Expresión de genes foráneos es posible gracias a la inserción de un nuevo sitio de iniciación viral ARN subgenómico o promotor. ATS en el cual se coloca una secuencia de genes exógenos 5 'de los genes estructurales viral se utiliza para la expresión de la proteína estable en los insectos. ATS, en el que se coloca a una secuencia de genes 3 'de los genes estructurales, se utiliza para desencadenar la expresión RNAi y el silencio de ese gen en los insectos.

ATS han demostrado ser herramientas valiosas para la comprensión de las interacciones patógeno-vector, los detalles moleculares de la replicación viral y los ciclos de mantenimiento infecciosas ^{3,4,11,19,21.} En particular, la expresión de los periodistas fluorescentes y bioluminiscentes ha sido fundamental para el seguimiento de la infección viral en la transmisión del vector y el virus de ^5,14-16,18. Además, la respuesta inmune del vector que se ha descrito el uso de dos cepas de SINV para expresar GFP ^2,9.

A continuación, presentamos un método para la producción de SINV contiene un reportero fluorescente (GFP) de la clon infeccioso de cDNA. Infecciosa, de larga duración en el ARN se transcribe a partir del clon de ADNc linealizado. RNA infeccioso se introduce en las células diana permisiva de la electroporación. Células transfectadas generar partículas infecciosas del virus que expresan el Gobierno de la India. Virus de la cosecha se usa para infectar a los mosquitos, como se describe aquí, o de otras especies de acogida (no mostrado aquí). Competencia del vector se determina mediante la detección de la fluorescencia fuera del intestino medio o por la transmisión de seguimiento del virus ^7. El uso de un fluorescente reportero como el Gobierno de la India permite una estimación conveniente de propagación del virus a través de un cultivo celular, para la determinación de la tasa de infección, la difusión de los mosquitos expuestos, la transmisión del virus del mosquito y es un indicador rápido de la competencia vectorial.

Protocolo

El protocolo siguiente se escribe para la producción y el uso de un ATS basado en el virus Sindbis MRE16. El ATS ha sido diseñado para expresar las buenas prácticas agrarias en el mosquito vector Aedes aegypti. cDNA clones infecciosos de una serie de alfavirus (virus Sindbis, virus Chikungunya, O'nyong-nyong virus, el virus de la encefalitis equina del oeste) se encuentran actualmente disponibles que han sido diseñados como ATS (Tabla 1). Para obtener los mejores resultados de ADN plásmido se amplifica en las bacterias tales como bacterias QUE competentes (Stratagene / Agilent Technologies) para evitar la recombinación no deseados y la pérdida del ADNc viral. Todos los plásmidos clon infeccioso tienen un bacteriófago T7 o SP6 promotor en la inmediata extremo 5 'del ADNc viral para la transcripción de ARN genómico de longitud completa y una endonucleasa de restricción única en el extremo 3' de la transcripción de la escorrentía. Para cada ATS, los usuarios deben utilizar la polimerasa del bacteriófago ADN dependiente de ARN apropiada y endonucleasa de restricción única para la transcripción in vitro del genoma viral ARN.

1. Generación de ARN Infecciosas del clon de cDNA.

1. Linealizar la 5μg del clon infeccioso plásmido (p5'dsMRE16 / GFP) con 20 unidades de enzima de restricción XhoI en una reacción de 100 mL. Incubar durante 2-3h a 37 ° C
2. Purificar el ADN lineal utilizando Qiagen QIAprep Spin Miniprep protocolo del kit de purificación alternativo, liberador de ADN de la columna de giro con 50 l de RNasa libre de agua. Concentración de plásmido debe ser de aproximadamente 1,0 mg / mL.
3. En una RNasa libre de tubo de PCR de 0,2 ml, puesta en marcha una reacción de 50 l de transcripción utilizando Ambion Kit MAXIscript según el protocolo de la siguiente manera.
   
   • 22,5 l RNasa libre de dH ₂ O
     • 5,0 l plantilla de ADN linealizado (1,0 mg / l)
     • 2,5 l ATP 10 mM
     • 2.5 l 10 mM CTP
     • 2,5 l UTP 10 mM
     • 2,5 l GTP 1 mM
     • 2.5 l 10 mM tapa analógica (m ⁷ G (5 ') ppp (5') G)
     • 5,0 l de transcripción buffer 10X
     • 5,0 l T7 o SP6 mezcla polimerasa
   • 50,0 Total l
4. Incubar la reacción de transcripción durante 1 hora a 37 ° C. Después de la incubación, la reacción debe ser utilizado inmediatamente para la electroporación de células BHK-21. Preparación de las células BHK-21 para la electroporación debe comenzar durante la reacción de incubación de la transcripción.

2. Generación de virus de RNA infeccioso

1. Trypsinize dos 70-80% confluentes 150 cm ² (T-150) frasco de células BHK-21 por ATS.
2. La transferencia de todas las células a un tubo de 15 ml de centrífuga cónico.
3. Precipitar las células por centrifugación a 2000 rpm, 10 min, 4 ° C en una centrífuga de mesa convencional.
4. Resuspender las células en PBS estéril sin Mg + + y Ca + +. Repita los pasos 2.3 y 2.4 hasta que las células se han lavado tres veces con PBS.
5. Resuspender las células sedimentadas MEM 0,5 ml que contiene 10% de SFB.
6. Diluir 10 ml con 90 células MEM l con 10% de SFB y contar con un hemocitómetro. Si las células es necesario, diluir a 2.5 a 12.5 x 10 ⁷ células / ml con MEM con 10% de SFB.
7. A una helada 0,2 cm cubeta de electroporación, añadir 400 l de suspensión celular y 20 l reacción de transcripción. Limpie la condensación de la cubeta.
8. El pulso de la cubeta en dos ocasiones: 450V, 1200Ω, 150 mF. Nosotros usamos un manipulador célula electroquímica, Harvard Apparatus modelo ECM630.
9. Coloque todo el contenido de la cubeta en una de 25 cm ² frasco de cultivo de tejido que contiene 5 ml de MEM con 10% de SFB.
10. Frasco se incuba (s) a 37 º C con CO2 al _5%.
11. Monitor de la infección a diario usando un microscopio de fluorescencia invertido con el conjunto de filtro adecuado (por ejemplo, las buenas prácticas agrarias filtro: longitud de onda de excitación de 460-490 nm =, la emisión de longitud de onda de 510-550 nm =, o dsRed filtro: longitud de onda de excitación de 460-560 nm =, la emisión de longitud de onda => 590 nm).
12. Cuando fluorescencia sugiere la infección es confluente y / o CPE es visible en todo el frasco, recoger el contenido del frasco, añadir 30% de SFB, alícuota que sea necesario, y guardar a -80 ° C. Si lo desea, lisados ​​de células pueden ser aprobados por centrifugación (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) antes de la adición de FBS.
13. El paso del virus al menos una vez a través de un nuevo frasco de las células para aumentar el título del virus para su posterior ensayos se alimentan de sangre.

3. La infección por vía oral de los mosquitos

1. Mezcle la sangre (por lo general compra de fibrinated-sangre de oveja) y el cultivo de células de suspensión derivado del virus desde el paso 2.13. Título del virus en la final de la harina de sangre debe ser normalmente ~ 1x10 ⁷ unidades formadoras de placas (UFP) / ml para la infección del intestino medio eficiente de los mosquitos. Para estimular los mosquitos se llenen, la adenosina 5'-trifosfato (ATP) se pueden agregar a una concentración final de 0,02 M.
2. Los mosquitos puedentienen que ser privados de agua y azúcar antes de la infección para estimularlos para alimentar eficientemente la sangre de un alimentador artificial. Duración de la privación deben estar establecidas previamente para minimizar la mortalidad. Veces depende de las especies de mosquitos, la humedad del insectario, etc Como punto de partida, retire las 24 horas de azúcar y agua antes de las 12h a la alimentación. Este protocolo utiliza con camisa de agua de vidrio con feeders17 circulando agua a 37 ° C. Una membrana intestinal porcina (es decir, lavar muy bien embutido disponible en las tiendas de comestibles) se coloca sobre la boca de la alimentación y la comida está contaminada en la cámara. Varios diseños, las membranas y los protocolos están disponibles para los tipos de vectores diferentes.
3. Los mosquitos son ordenados para seleccionar sólo a los mosquitos llena de sangre. Mosquitos congestionados son transferidos a una caja de cartón con el organdí en la parte superior y los mosquitos se incuban a 28 ° C, 75-80% de humedad relativa hasta su transformación para la expresión de GFP.

4. La inoculación intratorácica de mosquitos

Inoculación intratorácica es un método alternativo para infectar a los artrópodos. Este método se utiliza cuando la difusión a través del intestino medio no es necesario. (Método descrito a continuación, pero la técnica no se muestra en este experimento visual).

1. Un pequeño número de mosquitos (5-10) se aspira a partir de la explotación en jaulas de plástico tubos de mantenimiento. Los tubos sellados explotación se coloca a 4 ° C durante 15 minutos para enfriar los mosquitos.
2. 2 5 mosquitos se derrama desde el tubo en una placa de Petri de vidrio que descansa sobre el hielo. Coloque la tapa en la caja de Petri, cuando no esté en uso o si los mosquitos empiezan a moverse. Durante la manipulación de los mosquitos, se debe tener cuidado para contar y realizar un seguimiento de la cantidad de mosquitos manipulados. Ya que los mosquitos se derrama sobre la mesa fría, el número total se registran en las necesidades del laboratorio.
3. La aguja se prepara por fusión de los tubos capilares de vidrio con Nanoject específico y un extractor de aguja.
4. Configuración de la II Nanoject microinyector según las instrucciones del fabricante para la entrega de 69 nL inóculo. Se debe tener cuidado en la elaboración del inóculo en la aguja de modo que la aguja no esté dañado.
5. Utilizando un microscopio de disección, insertar la aguja en el tórax del mosquito y activar el Nanoject para la inoculación. Se debe tener cuidado cuando la inoculación de mosquitos, para que la aguja no penetre por completo el mosquito y salir del otro lado, lo que resulta en la posterior muerte del mosquito. Compruebe cada mosquito para estar seguro de que el inóculo entró antes de sacarlo de la aguja.
6. Después de la inoculación, mientras que el mosquito sigue siendo atravesado por la aguja, colóquelo en una caja de cartón de papel a través de la celebración de un pequeño agujero en el lado que se conecta con un algodón o un tapón de corcho en cualquier otro momento.
7. Cuando los mosquitos se han inoculado y se coloca en la caja (hasta aproximadamente el 50 por caja), la cinta con cuidado el tapón en su lugar para evitar la liberación accidental de los mosquitos. Coloque las cajas en un contenedor seguro antes de la celebración de incubación en el insectario a 28 ° C y% de humedad relativa del 80.

5. Seguimiento de la infección de los mosquitos

1. Coloque la caja de cartón de papel mantenimiento a 4 ° C durante unos 15 minutos para inmovilizar a los mosquitos.
2. La transferencia de un pequeño número de mosquitos (5-10 a la vez) en una tabla de frío adaptado para su uso en un microscopio de fluorescencia.
3. Examinar y clasificar los mosquitos basada en la presencia o ausencia de fluorescencia. Además, la intensidad de fluorescencia se puede utilizar como una medida representativa cuantitativa de la infección. Tejidos de mosquitos, tales como intestino medio, las glándulas salivales, la grasa corporal pueden ser analizados y monitoreados por fluorescencia.
4. En su caso, devolver los mosquitos seleccionados para cartón de papel para continuar la incubación de mosquitos infectados.

6. Ensayo de transmisión (salivación obligada a demostrar la transmisión del virus)

1. Privar a los mosquitos de la fuente de azúcar durante 24 horas antes de la alimentación.
2. Quitar las patas y las alas
3. A un tubo de 50 l capilar que se ha calentado, se retiró y cortó en un extremo, agregar 5.3 L de aceite de inmersión Cargille Tipo B o el 10% de suero sacarosa solución.
4. Inserte la trompa en el tubo. Si se utiliza el aceite, las gotitas de saliva se verá que emanan de la trompa. Una L de una solución pilocarbine 1% en PBS y 0,1% Tween 80 se puede aplicar en el tórax para estimular.
5. Después de 60-90 minutos, eliminar los mosquitos y el almacén para el aislamiento del virus, si es necesario.
6. Retire la solución desde el tubo de centrifugación en un tubo que contiene 100 l 20% de SFB-PBS.
7. Filtro estéril el inóculo a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras y luego usar el filtrado del inóculo para infectar las células cultivadas.

NOTA DE BIOSEGURIDAD: Este protocolo describeun método de generación, identificación y control de mosquitos infectados. Con base en sus instalaciones (es decir, una mesa de enfriamiento, instalación de contención, etc) y la aprobación del CIB, que puede estar limitado a examinarlas sólo después de la eliminación de las alas y las piernas para evitar fugas. SINV basado ATS se puede generar y utilizar en un entorno BSL2. El uso de estimulantes de tipo anfetamínico, basada en alfavirus tales como virus Chikungunya o la encefalitis equina del oeste virus requerirá BSL3 instalaciones.

7. Resultados representante

Una visión general de la expresión de un gen marcador (GFP), utilizando el 5'dsMRE16 ATS / GFP se muestra en la Figura 1. Expresión de GFP en células BHK-21 y C6/36 (Aedes albopictus), las células se muestra en la Figura 2 en determinados momentos después de la infección de células con 5'dsMRE16 / GFP virus en 0,01 multiplicidad de infección. La figura 3 es una visión general de infección por el virus alfavirus y ATS en el mosquito cuando el virus llega a través de una ingestión de sangre infectante. La Figura 4 muestra la preparación de una comida de sangre con ~ 10 ⁷ ufp / mL del virus de la ATS seguida de la infección oral de Aedes aegypti. Ver todo el cuerpo de los mosquitos infectados y las partes seleccionadas del cuerpo a los 10 días después de la infección usando un microscopio de epifluorescencia (Figura 5). Detección de buenas prácticas agrarias y DsRed en midguts de mosquitos infectados después de la infección con el virus de la ATS 5'dsMRE16 expresando cada gen marcador fluorescente (Figura 6). Ensayo de transmisión con los mosquitos infectados con 5'dsMRE16 / GFP ATS virus (Figura 7).

Tabla 1. ATS actualmente diseñados para la expresión del gen en los mosquitos.

Alfavirus	ATS	Mosquito	De referencia
Sindbis virus	TE / TE 3'2J y / 5'2J	Aedes aegypti	12
		Ochlerotatus triseriatus	13
	3'dsMRE16 y 5'dsMRE16	A. aegypti	5
		Culex tritaeniorhynchus	5
	5'dsTR339	A. aeg ypti	2
Virus chikungunya	3'dsCHIKV y 5'dsCHIKV	A. aegypti / A. albopictus	20
O'nyong nyong virus	5'dsONNV	Anopheles gambiae	1,9
Oeste de virus de la encefalitis equina	5'dsWEEV. McMillan	Culex tarsalis	Stauft et al., Sin publicar

Tabla 2. Ventajas / desventajas del uso de estimulantes de tipo anfetamínico para la expresión del gen en los mosquitos.

Ventajas:

Rápida producción de alto título de virus

Amplia gama de huéspedes (SINV)

Alta tasa de replicación del ARN

Los altos niveles de expresión del transgen

La relativa facilidad de manipulación de genes

La expresión estable, persistente gen en los insectos

Mínima patología de los insectos

Desventajas:

A corto plazo en el modo de expresión de células de vertebrados

Fuertes efectos citopáticos en las células de vertebrados

Restricciones gen tamaño (<1Kb, idealmente)

Algunos requieren alfavirus BSL3 contención

Figura 1: Resumen de la producción de virus de ETA en células BHK-21 con p5'dsMRE / GFP GFP SINV expresa. Después de la transcripción in vitro, ARN genómico ATS es electroporación en células BHK-21, donde el virus es rescatado. El virus de la ATS puede entonces ser utilizada para infectar a los mosquitos. PEC = promotor subgenómico. Tres ATS especies de ARN se transcriben en el cells, la genómica, subgenómico 1 y 2 ARN subgenómico. C (cápside), glicoproteínas E2 y E1 se ensamblan con ATS genoma para generar virus infecciosos.

Figura 2: La expresión de GFP en el mosquito (C6/36), las células después de la infección con SINV 5'dsMRE16 / GFP virus.

Figura 3: Vista de una infección por el virus de ETA en los mosquitos que conducen a la transmisión del virus.

Figura 4: ATS SINV 5'dsMRE16 la infección mediante la exposición de mosquitos a una ingestión de sangre infectante.

Figura 5: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP infección a los 10 días post infección. Detección de cuerpo entero de las buenas prácticas agrarias muestra que el virus ha escapado del intestino medio y difundido a los tejidos secundarios. Figura también muestra la expresión de GFP en partes del cuerpo seleccionado que también es indicativo de una infección diseminada.

Figura 6: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP y 5'dsMRE16 / DsRed infección de intestino medio en determinados momentos de la infección. Midguts por lo general tienen distintos focos de infección poco después de ingerir una comida de sangre que contiene el virus que se propaga a través del intestino posterior, a veces más tarde después de la infección.

Figura 7: La detección de estimulantes de tipo anfetamínico 5'dsMRE16 / GFP en la saliva de los mosquitos a los 8 días post infección. Ensayo está diseñado para demostrar la transmisión del virus de la ATS y demuestra que el virus 5'dsMRE16 / GFP estable puede expresar GFP en todo el período de incubación extrínseco en el mosquito. El panel izquierdo muestra un mosquito agua la boca en un tubo capilar, el panel central muestra las células C6/36 infectadas con la saliva en un día y panel de la derecha tres días post infección.

Discusión

Los métodos presentados aquí permiten a los investigadores a seguir en la infección de un alfavirus en cultivos de células de mosquito y la hembra del mosquito adulto. Las ventajas y desventajas del uso de estimulantes de tipo anfetamínico virus se resumen en la Tabla 2. Un clon de ATS infecciosas pueden ser manipulados genéticamente para expresar cualquier Gobierno de la India y se han utilizado para expresar anticuerpos de cadena simple, supresores del ARNi, ARN antisentido dirigidos genes endógenos y proteínas pro-apoptóticas. Si un periodista no se usa, entonces la porción de imagen de este método no es relevante. Sin embargo, muchos de los mismos protocolos que son necesarios para el rescate de virus ATS, propagación e infección de los mosquitos. Hay limitaciones en el tamaño máximo de los transgenes cuando se inserta en un sistema de transducción de alfavirus. Las restricciones de tamaño varían dependiendo de la cepa parental utilizada para generar el ATS, pero suelen ser de 1 kb, aunque más genes reporteros como luciferasa de luciérnaga se han utilizado en la construcción de ATS para su uso en los mosquitos. Laboratorios de investigación con una pequeña cantidad de fondo virología debe ser capaz de utilizar ATS tras estos protocolos. Un número de laboratorios de investigación lo ha hecho con SINV basado en ATS.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104
MAXIscript Kit	Ambion	AB1312	Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct.
Cap Analogue (m7G(5’)ppp(5’)G)	Ambion	AM8050
Nanoject II nanoliter injector	Drummond Scientific	3-000-204
Electro Cell Manipulator	Harvard Apparatus	ECM 630